[發明專利]同時檢測HBA1/2和HBB基因突變的試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201910514793.1
• 申請日: 2019-06-13
• 公開（公告）號: CN112080558A
• 公開（公告）日: 2020-12-15
• 發明（設計）人: 毛愛平;韓晉;張曉杰;張建光
• 申請（專利權）人: 北京貝瑞和康生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 孟凡宏;謝燕軍

本發明涉及一種同時檢測HBA1/2和HBB基因突變的試劑盒和方法，其中所述試劑盒包括以下試劑：(1)用于多重PCR擴增HBA1/2和HBB基因片段的試劑；和(2)用于構建PacBio文庫的試劑。

技術領域

本發明涉及一種利用PacBio長讀長測序平臺同時檢測 HBA1/2和HBB基因突變的方法，以及適用于此方法的試劑盒。

背景技術

血紅蛋白(Hemoglobin，簡稱Hb)是紅細胞內運輸氧的特殊蛋白質。成年人血紅蛋白(Adult Hemoglobin，簡稱HbA)是由兩對α-珠蛋白和兩對β-珠蛋白組成的四聚體。α-珠蛋白或β-珠蛋白的合成缺失或不足會導致珠蛋白生成障礙性貧血，又稱地中海貧血。由α-珠蛋白基因突變引起的α珠蛋白缺失或不足稱為α- 地中海貧血(簡稱α-地貧)；由β-珠蛋白基因突變引起的β珠蛋白缺失或不足稱為β-地中海貧血(簡稱β-地貧)。地貧是世界上最常見的單基因遺傳病，屬常染色體隱性遺傳，主要分布在地中海沿岸和東南亞國家等。

人源α-珠蛋白(alpha-globin)基因簇位于16號染色體，共包含7個基因位點：5’-zeta-pseudozeta-mu-psedudoalpha-1- alpha-2-alpha-1-theta-3’。其中只有HBA1(alpha-1)和HBA2 (alpha-2)兩個基因在胚胎和成年人中具有編碼珠蛋白的能力，其他均為假基因或預測基因，或只在胚胎發育早期翻譯表達珠蛋白。HBA1和HBA2基因的編碼區域完全相同，在5’非編碼區 (UTR)和內含子區域有少量堿基的不同，主要的差別集中在 3’UTR。HBA1和HBA2基因的突變包括缺失型和非缺失型突變。目前已經發現約50種α-珠蛋白基因簇區域的缺失可導致α-珠蛋白表達的減低或缺失，其中最常見的三種缺失型是-α^3.7、-α^4.2和--^SEA。如圖1所示，HBA1和HBA2基因區域和附近有兩個約 4Kb的進化上高度同源區域，按照序列可分為X/Y/Z和 X₂/Y₂/Z₂。Z和Z₂區域相隔3.7Kb，兩個區域之間的重組會導致α-珠蛋白基因缺失1個拷貝，產生-α^3.7缺失型突變。X和X₂區域相隔4.2Kb，兩個區域之間的重組也會導致α-珠蛋白基因缺失 1個拷貝，產生-α^4.2缺失型突變。而--^SEA缺失區域超過19Kb，包含α-珠蛋白基因簇中HBA1和HBA2在內的多個基因。目前全球已報道至少70種導致點α-珠蛋白表達降低或缺失的點突變，其中在中國最常見的三種點突變類型是位于HBA2基因上的QS、CS和WS。

人源β-珠蛋白(beta-globin)基因簇位于11號染色體，共包含5個基因位點：5’-epsilon-gamma-G-gamma-A-delta-beta -3’。其中只有HBB(beta)基因在成年人中編碼珠蛋白，其他四個基因均在胚胎發育過程中表達，或者在成年人中表達量非常低。HBB基因的突變主要是非缺失型突變，包括單點突變，小的插入和缺失等。目前全球已經有超過300種HBB基因的突變被報道，但是其中會引起90％人群的β-珠蛋白表達缺失或減少的常見突變為40種左右。引起β-珠蛋白表達減少的突變主要集中在HBB基因區域，通過影響轉錄、RNA加工、mRNA剪接和翻譯等來降低β-珠蛋白的表達。在中國，最主要的17種突變占HBB 基因致病性突變的95％以上，包括-32(C-A)、-30(T-C)、-29(A-G)、 -28(A-G)、Cap+40-43(-AAAC)、Int(T-G)、CD14/15(+G)、 CD17(A-T)、CD26(G-A)、CD27/28(+C)、CD31(-C)、 CD41/42(-TCTT)、CD43(G-T)、CD71/72(+A)、IVS-I-1(G-T， G-A)、IVS-I-5(G-C)和IVS-II-654(C-T)。