[發(fā)明專利]豬NR1H3基因過表達載體質粒的構建方法及其表達水平的檢測

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• 申請日: 2019-06-13
• 公開（公告）號: CN110218724A
• 公開（公告）日: 2019-09-10
• 發(fā)明（設計）人: 曹果清;高鵬飛;張雪蓮;郭曉紅;秦本源;劉敏;王媛媛;張萬鋒;王海珍;宋鵬康;蔡春波;李步高
• 申請（專利權）人: 山西農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/85;C12N15/66;C12N15/65;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;商秀玲

1.用于構建豬NR1H3基因過表達載體質粒的引物，其特征在于，包括引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1-2所示。

2.一種構建豬NR1H3基因過表達載體質粒的方法，其特征在于，利用引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R PCR擴增NR1H3基因，利用同源重組方法將NR1H3基因與pIRES2-EGFP-3×flag連接；

所述引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1-2所示。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取豬組織的總RNA，反轉錄成cDNA；

(2)以步驟(1)的cDNA為模板，利用引物TY-NR1H3-F和TY-NR1H3-R PCR擴增NR1H3基因；

(3)利用限制性內切酶NheI和EcoRI雙酶切pIRES2-EGFP-3×flag；

(4)將所述NR1H3基因與經雙酶切的pIRES2-EGFP-3×flag進行同源重組連接，構建豬NR1H3基因過表達載體質粒；

優(yōu)選地，所述PCR擴增的反應程序如下：95℃預變性5min，95℃變性15s，63℃退火15s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃延伸10min。

4.豬NR1H3基因表達水平的檢測引物，其特征在于，包括引物N2F和N2R，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:3-4所示。

5.含有權利要求4所述檢測引物的試劑盒；

優(yōu)選地，所述試劑盒還包括用于擴增18S rRNA內參基因的引物18S-F和18S-R，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO:5-6所示。

6.權利要求4所述檢測引物或權利要求5所述試劑盒在檢測豬NR1H3基因表達水平中的應用。

7.一種豬NR1H3基因表達水平的檢測方法，其特征在于，利用權利要求4所述檢測引物或權利要求5所述試劑盒進行熒光定量PCR檢測。

8.根據權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取待測豬細胞的總RNA，反轉錄成cDNA；

(2)以步驟(1)的cDNA為模板，利用引物18S-F和18S-R熒光定量PCR擴增18S rRNA內參基因，同時利用引物N2F和N2R熒光定量PCR擴增NR1H3基因；

(3)分析步驟(2)的熒光定量PCR結果，獲得豬NR1H3基因表達水平。

9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的反應程序為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，45個循環(huán)；95℃15s，65℃1min，95℃15s制作熔解曲線。

10.根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR的20μL反應體系為：2×GoTaq qPCR Master Mix10μL，去RNA酶水7.4μL，10μM上游引物0.3μL，10μM下游引物0.3μL，cDNA模板2.0μL。