[發明專利]一種整合式核酸檢測裝置

有效

• 申請號: 201910484139.0
• 申請日: 2019-06-05
• 公開（公告）號: CN110129188B
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發明（設計）人: 劉海云;何濤;高奕;于京華
• 申請（專利權）人: 濟南大學
• 主分類號: C12M1/34
• 分類號: C12M1/34;C12M1/00;C12Q1/6844;C12Q1/689;C12Q1/10;C12R1/42
• 代理公司: 濟南譽豐專利代理事務所(普通合伙企業) 37240
• 代理人: 李茜

1.一種整合式核酸檢測裝置，其特征是包括以下步驟：

（1）裝置的設計

該整合式檢測裝置設計為多層板狀樣式，核心結構分為上層樣品板，中層滑動板和下層電極板，由磁板結合粘貼膜和紙電極芯片構建而成，磁板和粘貼膜的尺寸為15 cm × 5cm,紙電極芯片的尺寸為3 cm × 3 cm，上層樣品板有三個直徑5 mm的圓孔和一個2 mm深3cm長的正方形槽，三個圓孔分別用于滴加生物樣品、純化緩沖液和擴增試劑，正方形槽用于放置印有碳電極和銀電極的紙芯片，中層滑動板由一個可滑動的磁板和兩條固定磁條組成，可滑動的磁板有一個直徑5 mm的圓孔，圓孔中塞有直徑5 mm的、用于從生物樣本中提取核酸的FTA圓盤；通過抽拉可滑動的磁板，使FTA圓盤與上層樣品板的圓孔對齊，即可通過上層圓孔完成生物樣品、純化緩沖液和擴增試劑的滴加，下層電極板包含一個10 cm × 5 cm大小的吸收板和一個5 cm × 5 cm的磁板，在磁板上有一個2 mm深3 cm長的正方形槽，吸收板用于從FTA圓盤中吸收細胞裂解后的廢物，正方形槽用于放置印有工作電極的紙芯片，在紙電極芯片的工作電極區域修飾金納米粒子，以對工作區域進行改性，利用磁板的吸引力和粘貼膜，構建了一個密閉的擴增反應室，以保證在反應室中等溫擴增反應能順利的進行，將三層板和粘貼膜依次堆疊起來，擠壓成型；

（2）裝置的制造

利用數字化切割機將磁板和粘貼膜切割為15 cm × 5 cm大小，并在磁板和粘貼膜的特定位置用打孔機打5 mm的圓孔，利用切割機將Whatman紙切割為10 cm × 5 cm大小，紙電極芯片的構建的具體步驟如下：利用蠟打印技術在色譜紙上打印圖案，將打印蠟的圖案放在恒溫150 oC下2 min，未打印蠟的地方為親水區，紙電極芯片的疏水屏障形狀是由Adobe illustrator CS6軟件設計的，利用絲網印刷銀/氯化銀參比電極，碳對電極和碳工作電極組成，此外，它還包含一個直徑7 mm的輔助區和直徑7 mm的一個工作區域，在紙電極芯片的工作區域修飾Au納米粒子的具體步驟如下：首先將80 mL 蒸餾水加熱至90 ℃，然后加入0.8 mL 質量分數為 1% 的氯金酸溶液繼續加熱至96 ℃ 保持1分鐘，最后加入2.8 mL質量分數為 1% 的檸檬酸鈉，加熱8分鐘得到金種子溶液，取20 μL 金種子溶液滴加在工作層親水區域，靜置晾干，重復三次，制備得到修飾金納米粒子的工作電極；

（3）裝置的使用步驟

用標準加入沙門氏菌的牛奶作為分析模板來驗證該裝置的可行性，沙門氏菌的培養步驟如下：將鼠傷寒沙門氏菌在Luria-Bertani（LB）平板上37 ℃過夜培養，然后，選取單個鼠傷寒沙門氏菌菌落刺破并在10 ml LB液體培養基中37℃過夜生長，同時以110 rpm搖晃，用紫外分光光度計測量細菌懸浮液在600 nm處的吸光度（OD 600），來確定細菌濃度，將細菌懸浮液用PBS緩沖液分別稀釋1、10、100、500和1000倍，取10 μL等量的鼠傷寒沙門氏菌稀釋液分別加入100 μL牛奶中，搖晃混合均勻，取10 μL加入1倍稀釋細菌的牛奶，通過上層樣品板的樣品孔滴加至FTA圓盤上，室溫干燥15 min，用于裂解細胞和提取核酸；15 min后，滑動中間磁板，使FTA圓盤與上層樣品板的清洗孔對齊，滴加45 μL FTA純化試劑和90 μL清洗緩沖液，清洗細胞裂解物；65 ℃加熱5 min,干燥FTA圓盤；干燥后，繼續滑動中間磁板，使FTA圓盤與上層樣品板的試劑孔對齊，滴加15μL等溫擴增反應混合溶液；再次滑動中間磁板至白色標線露出，使FTA圓盤滑動至密閉的擴增反應室；將整個裝置放置熱板上65 ℃加熱60min，使等溫擴增反應充分進行；60 min后，將裝置從熱板上取下，在冷卻至室溫后，將裝置的碳電極、銀電極和金電極連接至電化學工作站，用差分脈沖伏安法（DPV）測量并記錄電流響應，同樣的步驟用于10、100、500和1000倍稀釋細菌的牛奶樣本。