[發明專利]泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表達純化方法

有效

• 申請號: 201910479903.5
• 申請日: 2019-06-04
• 公開（公告）號: CN110205313B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 閆巧娟;江正強;劉學強;楊紹青;馬帥;余靜
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/02;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

本發明公開了泡盛曲霉β?1,3?1,4?葡聚糖酶的表達純化方法。本發明提供了一種生產β?1,3?1,4?葡聚糖酶的方法，包括將泡盛曲霉β?1,3?1,4?葡聚糖酶編碼基因導入受體酵母；將重組酵母于BSM培養基培養，待甘油消耗完全進行甘油補料發酵階段、甲醇補料誘導表達階段和混合補料誘導表達階段。本發明工程菌經高密度發酵，發酵液酶活可達159500U/mL(蛋白含量31.7mg/mL)。所產β?1,3?1,4?葡聚糖酶最適pH5.0，在pH 2.0?9.0保持穩定；最適溫度55℃，在60℃以下保持高酶活力；底物特異性專一。本發明在食品、飼料等行業具有應用價值。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表達純化方法。

背景技術

β-葡聚糖酶是一類能夠降解谷物中β-葡聚糖的酶類，包括β-1,3-1,4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3.2.1.73)、β-1,4-葡聚糖酶(纖維素酶，EC 3.2.1.4)、β-1,3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3.2.1.39)和β-1,3(4)-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)(專利號：CN201410246941，申請日：20140530)。其中，β-1,3-1,4-葡聚糖酶具有嚴格的底物特異性，其水解β-葡聚糖的3-O-取代葡萄糖殘基上的β-1,4-糖苷鍵，生成主要包含3-O-β-纖維二糖基-D-葡萄糖和3-O-β-纖維三糖基-D-葡萄糖的水解產物(專利號：CN201610416008，申請日：20160614；Yang et al.,Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56:5345-5351)。

β-1,3-1,4-葡聚糖酶廣泛應用于啤酒生產和飼料工業中。在啤酒生產中，β-1,3-1,4-葡聚糖酶能夠專一分解大麥葡聚糖，使大麥胚乳細胞壁疏松，促進細胞內溶物外溢，進而提高大麥的利用率，同時使糖化醪粘度降低，大大減少麥芽汁的過濾時間，還可增加啤酒產量，改善啤酒混濁度，提升啤酒的品質(專利號：CN201210197691，申請日：20120615；Furtado et al.,Process Biochemistry,2011,46:1202-1206)。在飼料工業中，β-1,3-1,4-葡聚糖酶能特異性將飼料中β-1,3-1,4-葡聚糖水解為葡寡糖，使植物細胞壁的構造遭到破壞，進而釋放出營養物質，并且降解后的葡寡糖沒有親水性和黏性，不僅防止β-1,3-1,4-葡聚糖在畜禽腸道中發生膨脹黏連，還提高了食糜消化率和飼料利用率(專利號：CN201110310945；申請日：20111014；Fernandes et al.,Animal Feed Science andTechnology,2016,211:153-163)。除此之外，β-1,3-1,4-葡聚糖水解物(葡寡糖)可促進人和動物體內益生菌的增殖，還可以改善機體的脂代謝和蛋白質代謝(Bode,NutritionReviews,2009,67:S183-S191)。