[發明專利]泡盛曲霉β-1,3-1,4-葡聚糖酶的表達純化方法

有效

• 申請號: 201910479903.5
• 申請日: 2019-06-04
• 公開（公告）號: CN110205313B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 閆巧娟;江正強;劉學強;楊紹青;馬帥;余靜
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/81;C12N1/19;C12P19/02;C12P19/14;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 張立娜

1.一種生產β-1,3-1,4-葡聚糖酶的方法，包括如下步驟：

（A）將來源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的編碼基因導入受體酵母，得到重組酵母；

（B）按照如下步驟對所述重組酵母進行發酵培養，從發酵產物中獲得β-1,3-1,4-葡聚糖酶：

B1）基礎發酵培養：將所述重組酵母接種于BSM培養基中培養，待甘油消耗完全進行甘油補料發酵階段；

B2）甘油補料發酵階段：在步驟B1）的基礎上，將甘油以30 mL/h/L起始發酵液的速度流加到發酵體系中，流加4h，待甘油消耗完全后饑餓1 h，然后進行甲醇補料誘導表達階段；

B3）甲醇補料誘導表達階段：在步驟B2）的基礎上，將甲醇以6 mL/h/L 起始發酵液的速度加流到發酵體系中，流加甲醇至菌體濕重達320 g/L時停止流加；

B4）混合補料誘導表達階段：在步驟B3）的基礎上，將甲醇以4-5 mL/h/L起始發酵液的速度，甘油以90 mL/h/L起始發酵液的速度同時流加到發酵體系中，流加至發酵結束；

步驟（A）中，所述來源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的編碼基因是通過重組載體的形式導入所述受體酵母中的；

所述重組載體為將表達盒按照順式-反式-順式依次串聯然后克隆到pPIC9K載體的多克隆位點后得到的重組質粒；所述表達盒由2×AOX1啟動子、α-factor信號肽的編碼基因、所述來源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的編碼基因和AOX1終止子順次連接而成；

步驟B1）中，所述培養的溫度為30℃、pH為5.0、控制溶氧大于20%；

步驟B2）中，所述甘油補料發酵階段的培養溫度為30℃、pH為5.0、控制溶氧大于20%；

步驟B3）中，所述甲醇補料誘導表達階段的培養溫度為30℃、pH為6.0、控制溶氧大于20%；

步驟B4）中，所述混合補料誘導表達階段的培養溫度為30℃、pH為6.0、控制溶氧大于20%；

所述酵母為畢赤酵母。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（A）中，所述來源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶為如下任一所示蛋白質：

a1）SEQ ID No.1自N末端第17至239位氨基酸殘基組成的蛋白質；

a2）由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

a3）在a1）或a2）所限定的蛋白質的N端和/或C端連接標簽后得到的融合蛋白。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：

所述α-factor信號肽的編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述2×AOX1啟動子的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述AOX1終止子的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述畢赤酵母為畢赤酵母GS115。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（A）中，所述來源于泡盛曲霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶的編碼基因為如下任一所述的DNA分子：

b1）SEQ ID No.2的自5′末端第49-720位所示的DNA分子；

b2）SEQ ID No.2所示的DNA分子。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：步驟B1）中，接種于所述BSM培養基中的所述重組酵母為所述重組酵母的種子液。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述種子液為將步驟（A）所得的重組酵母接種于BMGY培養基或YPD培養基，在30℃、200 rpm振蕩培養24-30 h所得。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：步驟B1）中，將所述種子液接種于所述BSM培養基為接種于裝有所述BSM培養基的發酵罐中，所述BSM培養基在所述發酵罐中的裝液量為所述發酵罐容積的1.5/5。