[發(fā)明專利]柑橘葉片DNA快速提取方法及其在柑橘黃龍病檢測中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910477013.0
• 申請日: 2019-06-03
• 公開（公告）號: CN110184266B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 關(guān)巍;李智鵬;黃洋;王鐵霖;楊玉文;趙廷昌
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/686
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

1.用于柑橘黃龍病檢測的柑橘葉片DNA快速提取方法，其特征在于，包括如下步驟：將來自待測柑橘植株的柑橘葉片的葉柄和葉中脈切碎，每30mg樣品加入40μL裂解液，渦旋震蕩10～15s后，95℃水浴15s，然后加入4倍裂解液體積的0.1mol/L，pH＝8的Tris-HCL，渦旋震蕩10～15s后，離心取上清，即得DNA溶液；

所述裂解液的配方為：0.5mol/L NaOH，1％TritonX-100；或0.5mol/L NaOH，1％SDS，1％TritonX-100；或0.5mol/L NaOH，1％PVP40，1％TritonX-100。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液的配方為：0.5mol/L NaOH，1％TritonX-100。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用96孔板作為容器進行DNA提取，每孔放置一個樣品。

4.柑橘黃龍病的高通量快速分子檢測方法，其特征在于，使用權(quán)利要求1-3任一所述的方法提取待測柑橘植株的葉柄和葉中脈的基因組DNA，取DNA溶液作為模板，針對柑橘黃龍病進行PCR檢測。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR檢測是指TaqMan實時熒光定量PCR。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述TaqMan實時熒光定量PCR使用如下核苷酸序列所示的引物和探針檢測柑橘黃龍病病原菌：

正向引物HLBas：5’-TCGAGCGCGTATGCAATACG-3’；

反向引物HLBr：5’-GCGTTATCCCGTAGAAAAAGGTAG-3’；

探針HLBp：5’-AGACGGGTGAGTAACGCG-3’；

其中，探針HLBp的5’端帶有第一熒光基團，3’端帶有可淬滅所述第一熒光基團的熒光的第一淬滅基團。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一熒光基團為FAM，所述第一淬滅基團為BHQ-1。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述TaqMan實時熒光定量PCR還使用如下核苷酸序列所示的引物和探針檢測植物細胞色素氧化酶：

正向引物COX-F：5’-GTATGCCACGTCGCATTCCAGA-3’；

反向引物COX-R：5’-GCCAAAACTGCTAAGGGCATTC-3’；

探針COXp：5’-ATCCAGATGCTTACGCTGGA-3’；

其中，探針COXp的5’端帶有第二熒光基團，3’端帶有可淬滅所述第二熒光基團的熒光的第二淬滅基團；所述第一熒光基團和所述第二熒光基團不同。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述第二熒光基團為VIC，所述第二淬滅基團為TAMRA。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述PCR的反應(yīng)體系為：2×Taq PCRMastermix 10μL，HLBas 1μL，HLBr 1μL，HLBp 0.8μL，COX-F 1μL，COX-R 1μL，COXp 0.8μL，DEPC H₂O 3.4μL，模板DNA 1μL；反應(yīng)程序為：95℃變性20s；95℃ 1s，58℃ 40s，40個循環(huán)。