[發明專利]CLRN3蛋白作為細胞表面標識蛋白在分離X精子中的應用

在審

• 申請號: 201910455581.0
• 申請日: 2019-05-29
• 公開（公告）號: CN110187127A
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 張勝利;沈丹;姜力
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569;C12N5/076
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

本發明公開了CLRN3蛋白作為細胞表面標識蛋白在分離X精子中的應用。CLRN3蛋白在哺乳動物X精子細胞的表面特異表達，CLRN3蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。本發明提供的分離X精子的方法不僅簡單易行，而且整個分離過程不需要使用染料和輻射，對精子細胞的壓力較小，對精子的有害影響也較小。本發明提供的方法可以滿足生產中對性控精液的大量需求。本發明具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及CLRN3蛋白作為細胞表面標識蛋白在分離X精子中的應用。

背景技術

奶牛性控精液技術被譽為人工授精和胚胎移植后的第三次良種快速擴繁技術革命，其主要是對X、Y精子進行有效分離，采用分離后的精子對母畜授精，從而生產出符合預期性別的后代。對于奶牛群體，通過分離優良奶牛的精液來進行輸精，從而達到奶牛品種快速改良的目的。同時性控精液的使用顯著提高了雌性后代的比例，為增加個體的選擇強度帶來了可能，從而加快了良種奶牛遺傳改良進程。

X、Y精子的分離是性控精液技術的關鍵。1980年，美國加利福尼亞的實驗室就開始嘗試對去膜精子進行分離。隨著分離技術的發展，目前根據X、Y精子的大小、活力、電荷、表面抗原和DNA含量等方面的差異，已報道的分離方法主要有密度梯度離心法、電泳法、蛋白免疫學分離法、流式細胞儀分離法等，但大部分方法都存在理論依據不足、重復性差、結果不可靠等問題，其中流式細胞儀分離法是目前最成功的對哺乳動物精子進行性別分類并得以妊娠的商業可行方法。然而，流式細胞儀分離法仍存在諸多弊端，如對精子細胞損傷大、有效精子數較少、人工授精后受胎率較低、對輸精技術要求較高，而且由于設備昂貴，分離速度慢，遠遠不能滿足生產上對性控精液的大量需求。此外，目前公牛X精子分離純度較高且基本穩定，但Y精子的分離純度很難達到90％。相比之下，利用蛋白免疫法(即抗原抗體反應原理)進行X、Y精子分離的方法簡單易行，而且有可能滿足生產中對性控精液的大量需求；而且其不需要使用染料和輻射，因此分離所花費的時間較少，對精子細胞的壓力也較小，從而減少對精子的有害影響。如果能夠鑒定到X、Y精子間的特異性標識蛋白，那么就可以針對其開發能夠分離X和Y精子的抗體，有望以較低的成本，高效、簡便的對奶牛精液實現X、Y精子分離，進而達到性別控制這一目標。然而，由于精子膜蛋白本身疏水性和低豐度等性質以及蛋白鑒定技術的限制導致目前鑒定到并得以成功應用的性別特異性蛋白寥寥無幾。

非標定量法(Label-free)是近年來重要的質譜定量方法，通過比較質譜信號響應強度或譜圖數目，分析不同來源樣品蛋白的豐度變化。非標定量法無需標記樣品，直接采取液相色譜-質譜聯用，對酶解后肽段進行質譜分析，得到某一細胞或組織的蛋白質定量信息。其基本原理是計算每個肽段信號在一級質譜上的積分得到定量結果，然后對所有肽段信號的二級質譜信息進行數據庫檢索得到定性結果；通過整合蛋白在不同樣品中表達量數據，達到鑒定在單一組中特異性表達蛋白的目的。此外Label-free利用的高效液相色譜，是一種高效的分離手段和分析技術，具有非常好的重現性和靈敏度，在單一蛋白質的分離和分析方面已經有較為廣泛的應用。

CLRN3蛋白正調控巴雷特食管干細胞向柱狀上皮細胞的分化，是檢測腸上皮化生的生物標志物之一。作為原發性肝細胞表面的N-糖鏈蛋白，CLRN3有助于純化誘導性多能干細胞(iPSCs)來源的類肝細胞均質群體。

發明內容

本發明的目的是分離哺乳動物X、Y精子。

本發明首先保護CLRN3蛋白的應用，可為S1)-S4)中至少一種：

S1)鑒定哺乳動物精子性別；

S2)制備用于鑒定哺乳動物精子性別的試劑盒；

S3)分離或篩選哺乳動物X精子；

S4)制備用于分離或篩選哺乳動物X精子的試劑盒。

本發明還保護檢測CLRN3蛋白的物質的應用，可為S1)-S4)中至少一種：