[發明專利]烏鶇系統發育樹的構建方法

在審

• 申請號: 201910378076.0
• 申請日: 2019-05-08
• 公開（公告）號: CN110106257A
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 姜立春;劉雷;張敏
• 申請（專利權）人: 綿陽師范學院
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;G16B30/10;G16B15/00
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 葛宏

本發明公開了一種烏鶇系統發育樹的構建方法，屬于分子生物學技術領域，包括以下步驟：(1)采集烏鶇標本；(2)烏鶇mtDNA基因組的提取；(3)引物設計和PCR基因擴增；(4)測序、拼接及序列分析；(5)構建系統發育樹，確定烏鶇及近緣物種系統分類地位；本發明分析烏鶇線粒體基因組序列特征以及重建了烏鶇與近緣物種系統發育樹，一方面可以讓烏鶇的分子信息庫更加完整，有利于對該屬物種以及近緣物種的進一步保護和利用，而且本發明也為其它鳥類的研究提供了研究基礎和分子數據。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種烏鶇系統發育樹的構建方法。

背景技術

烏鶇(學名：Turdusmerula)，屬于鳥綱(Aves)、雀形目(Passeriformes)、鶇科(Turdidae)、鶇屬(Turdus)，其分布廣泛，種群數量較多，在歐亞大陸、北非、印度次大陸、印度支那、斯里蘭卡、馬爾代夫，及中國的西南地區等地均為常見，分布高可至海拔4000m以上的山區。烏鶇是雌鳥孵卵，具有補卵行為和坐巢行為，為農林益鳥，某些地方利用烏鶇取食蝗蟲、草地螟、地老虎等害蟲的特點來達到生物防治害蟲的目的。這種生物防治手段不僅有效控制了蟲害，而且與公共植保、綠色植保、低碳植保方針相一致；所以，各種、亞種烏鶇的保護和利用越來越重要。但是，目前對于烏鶇的生物學信息和所處的系統進化地位了解很少，限制了對于各種、亞種烏鶇的進一步保護和利用。

發明內容

本發明的目的就在于提供烏鶇系統發育樹的構建方法，以解決上述問題。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案是這樣的：

一種烏鶇系統發育樹的構建方法，包括以下步驟：

(1)采集烏鶇標本；

(2)烏鶇總基因組的提取

從步驟(1)采集的烏鶇標本中提取烏鶇總DNA；

(3)引物設計和PCR基因擴增

設計可覆蓋烏鶇mtDNA全序列的引物，然后采用所述引物對步驟(2) 所得的總DNA，進行PCR擴增，擴增所得目的片段之間的重疊為100-200bp，得到基因樣本；

(4)測序、拼接及分析

將步驟(3)所得的基因樣本進行測序，然后利用測得的數據分析其線粒體全基因組的成分、基因的排列順序和堿基組成特征；再進行序列拼接，得到烏鶇線粒體基因組全序列，如SEQ ID NO:1所示；根據拼接得到的基因組全序列確定烏鶇的13個蛋白質編碼基因；預測各tRNA的二級結構，并根據預測結果繪制；最后對線粒體全基因組、13個蛋白質編碼基因、22個tRNA、2個rRNA 和D-loop進行特征分析；

(5)構建系統發育樹

根據已知的鳥類的13個蛋白質編碼基因，用白頰噪鹛和火尾希鹛13個蛋白質編碼基因作為外群，去終止密碼子后拼接，構建得到系統發育樹。

作為優選的技術方案：步驟(2)中，提取方法為SDS-酚-氯仿-異戊醇抽提法。

作為優選的技術方案：步驟(3)中，設計引物的方法為：根據NCBI上現已提交的6個烏鶇近緣物種的mtDNA全基因組序列，使用Primer5.0設計。

作為優選的技術方案：步驟(3)中，設計的引物對為12對，其具有如T1-T12 所示的序列。

作為優選的技術方案：步驟(4)中，所述序列拼接的方法為DNA Baser Assembler和人工排查。

作為優選的技術方案：步驟(4)中，所述確定烏鶇的13個蛋白質編碼基因的方法為：利用BLAST進行同源性搜索，通過對比NCBI上前人所提交的鶇屬其它鳥類的線粒體全基因組。