[發明專利]一種用于沃氏葡萄球菌檢測的試劑盒

有效

• 申請號: 201910370156.1
• 申請日: 2019-05-06
• 公開（公告）號: CN110144416B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 孫澤瑋;陳文靜;鄭良榮
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/44
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

本發明提供一種用于沃氏葡萄球菌檢測的試劑盒，包含一種特異性靶向沃氏葡萄球菌rpoB基因的向導RNA、擴增引物對、水化TwistAmp basic kit反應干燥球、LbCas12a蛋白、單鏈DNA探針(ssDNA)、Ribonuclease Inhibitor和緩沖液。使用該試劑盒進行沃氏葡萄球菌檢測，檢測的特異性高，可以將沃氏葡萄球菌與其他葡萄球菌，包括金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、溶血葡萄球菌區分開來。同時，使用本發明所述RNA序列進行檢測，耗時在1小時左右，不需要PCR儀，對設備要求低，顯著低于傳統的細菌培養法或PCR測序法，臨床實用價值大。

技術領域

本發明屬于致病菌檢測領域，涉及一種用于沃氏葡萄球菌檢測的試劑盒，包含一種特異性靶向沃氏葡萄球菌rpoB基因的向導RNA、RPA擴增引物對、水化TwistAmp basickit反應干燥球、LbCas12a蛋白、單鏈DNA探針(ssDNA)、Ribonuclease Inhibitor和緩沖液。利用此試劑盒可以進行沃氏葡萄球菌快速檢測。

背景技術

沃氏葡萄球菌是人體感染的革蘭陽性菌中常見菌群，給患者及社會帶來巨大負擔。傳統的檢測方法是進行細菌培養或PCR聯合測序，但細菌培養需要5-7天的時間，而PCR常由于缺乏特異性引物，無法將沃氏葡萄球菌與其他葡萄球菌區分，故而需要聯合一代測序才能鑒定，成本高，需要數天時間才能出結果。在這期間臨床醫師由于沒有獲得檢測結果，只能憑經驗用藥，常常導致疾病治療的延誤。因而，如何快速檢測沃氏葡萄球菌顯得尤為重要。近期，張峰等人發現，LbCas12a蛋白可用于致病菌的檢測，只需要1小時左右即可完成檢測，省時省力，靈敏度高。具體的原理為，該系統包含LbCas12a蛋白、致病菌DNA、向導RNA、兩端分別帶熒光基團和淬滅基團的單鏈DNA(ssDNA)。其中，致病菌DNA序列需要包含TTTN的PAM結構，同時該序列需要具備特異性，即區別于別的致病菌。而向導RNA序列為致病菌特異性靶向序列中TTTN后的一段序列，長度為20-24個堿基。在向導RNA引導下，LbCas12a蛋白可結合到致病菌特異性DNA序列上，隨后，LbCas12a蛋白可表現出Dnase活性，從而切割兩端分別帶熒光基團和淬滅基團的單鏈DNA，使得熒光基團和淬滅基團分離，出現熒光，從而指示致病菌的存在。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于沃氏葡萄球菌檢測的試劑盒，包含一種特異性靶向沃氏葡萄球菌rpoB基因的向導RNA、RPA擴增引物對、水化TwistAmp basic kit反應干燥球、LbCas12a蛋白、單鏈DNA探針(ssDNA)、Ribonuclease Inhibitor和緩沖液。其中特異性靶向沃氏葡萄球菌rpoB基因的向導RNA，其核苷酸序列如SEQ No.1所示，能特異性靶向沃氏葡萄球菌，而不能靶向金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、溶血葡萄球菌，可用于沃氏葡萄球菌的檢測。RPA擴增引物對RPA-F和RPA-R，序列如SEQ No.2和SEQNo.3所示。單鏈DNA探針的序列如SEQ No.6所示。

本發明的另一個目的是提供基于上述試劑盒進行沃氏葡萄球菌快速檢測的方法，通過以下步驟實現：

具體步驟為：取1ml樣品，95-98攝氏度加熱5min，取1μl作為檢測樣品，加入14.75μl水化TwistAmp basic kit反應干燥球(TwistDx公司)，0.9μl 10mM RPA-F(序列為SEQNo.2)和RPA-R(序列為SEQ No.3)，0.375μl Ribonuclease Inhibitor(Takara公司)，3.5μlbuffer2.1(NEB公司)，1000nM向導RNA(序列為SEQ No.1)，250nM Cas12a(NEB公司)，200nM單鏈DNA探針(上海生工，序列為SEQ No.6)，加水補至25μl。37攝氏度反應25-45min，通過熒光顯微鏡下直接觀察檢測體系熒光變化，進行沃氏葡萄球菌檢測；發黃綠色熒光說明有沃氏葡萄球菌污染，不發光說明沒有沃氏葡萄球菌污染。本方法可以將沃氏葡萄球菌與其他葡萄球菌，包括金黃色葡萄球菌、人葡萄球菌、表皮葡萄球菌、頭狀葡萄球菌、溶血葡萄球菌區分開來。