[發明專利]一種痕量cfDNA提取對接高通量測序文庫的優化方法

在審

• 申請號: 201910368793.5
• 申請日: 2019-05-05
• 公開（公告）號: CN110079869A
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發明（設計）人: 玥江;戴俊程;何元林
• 申請（專利權）人: 南京億科人群健康研究院有限公司
• 主分類號: C40B50/06
• 分類號: C40B50/06
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

本發明專利涉及到一種痕量cfDNA提取對接高通量測序文庫的優化方法，主要特征在于，溶液收集后加入等體積的酚氯仿，再加入100ng carrier DNA混合，并制備高效液相分離管，將消化后的液體轉移到高效液相分離管，高速離心進行液相分層，可回收98％以上的DNA溶液量。本發明專利具有獲得更高的文庫量和操作簡單等特征。

技術領域

本發明屬于生物醫藥服務領域，具體涉及一種痕量cfDNA提取對接高通量測序文庫的優化方法。

背景技術

游離循環DNA(cfDNA)存在于血液，包含雙鏈DNA片段，絕大多數是短鏈，而且通常濃度很低。在健康人體中，血漿cfDNA被認為來自于正常的造血細胞。cfDNA的循環半衰期很短，這提示它需要在細胞凋亡時被持續的釋放。在特定的生理條件或疾病過程中，有相當一部分cfDNA會與在健康的時候不同，基于這一結果，近年來cfDNA已被用于無創性診斷。在孕婦中，約有10％-15％的cfDNA來自于胎盤滋養層，現在cfDNA多用于在高危孕婦中篩查胎兒的遺傳缺陷，這就是是當前火熱的無創唐氏篩查的基礎！在腫瘤病人中，通過cfDNA的量化突變來檢測腫瘤已被越來越多的人認可。而在移植方面，移植排斥反應也與供體移植器官中的cfDNA水平相關。

cfDNA(Circulating cell-free DNA)、CTC和外泌體的檢測。目前GenomeAnalyzer IIx系統能夠同時對數億的序列進行測序，極大的擴展了基因組學，轉錄組學以及表觀遺傳組學等領域的研究分析能力。

然而，關于痕量cfDNA提取對接高通量測序文庫的方法存在著文庫量比較低等問題。

發明內容

本發明專利根據上述問題，提供了以下技術方案：

一種痕量cfDNA提取對接高通量測序文庫的優化方法，主要特征在于，溶液收集后加入等體積的酚氯仿，再加入100ng carrier DNA混合，并制備高效液相分離管，將消化后的液體轉移到高效液相分離管，高速離心進行液相分層，可回收98％以上的DNA溶液量。

進一步的，所述方法優化步驟包括如下：

(1).取200ul的血漿/血清樣品到1.5ml的離心管中；

(2).加入10μl的蛋白酶k工作液(20mg/ml),再加入20ul的裂解液；

(3).渦旋震蕩10sec混勻后，放入預熱至50-60℃的恒溫中過夜；

(4).溶液收集后加入等體積的酚氯仿，再加入100ng carrier DNA混合；

(5)制備高效液相分離管；

(6).將消化后的液體轉移到高效液相分離管，高速離心進行液相分層，可回收98％以上的DNA溶液量；

(7).加入1.3ml體積的無水乙醇，100ul3M醋酸鈉PH5.2，最大轉速4°離心60sec，棄上清；

(8).再加75％-80％酒精洗滌一次最大轉速4°離心60sec，棄上清。重復該步驟一次；

(9).晾干后水溶解；

(10).進入常規高通量測序文庫構建。

進一步的，所述步驟(3)中恒溫方式為金屬浴，水浴，沙浴；

進一步的，所述步驟(4)中加入100ng carrier DNA混合，carrier DNA為提取的高純度的線粒體DNA，用于提高溶液復雜度，提高cfDNA得率。

進一步的，所述步驟(5)制備高效液相分離管主要制備流程如下：