[發明專利]一種腫瘤相關基因突變位點篩查方法

在審

• 申請號: 201910364296.8
• 申請日: 2019-04-30
• 公開（公告）號: CN110396543A
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發明（設計）人: 陳翀;劉華勇;胡洋
• 申請（專利權）人: 廣州普世利華科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12N15/113
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 單香杰

本發明公開了一種腫瘤相關基因突變位點篩查方法。該技術綜合了gRNA靶向識別腫瘤相關突變基因轉錄產物RNA的優勢以及當CRISPR/Cas12a復合物檢測到靶標RNA序列時，復合物會切割帶有檢測標記的報告RNA，釋放可檢測信號的特點，將CRISPR/Cas12a系統應用在腫瘤相關突變基因檢測中，可在室溫下對腫瘤相關基因突變位點實現檢測高特異性、高靈敏度、高精度的分子檢測，還能夠實現多位點同時檢測，對腫瘤的檢測及篩查具有重要的意義。同時該方案檢測成本低廉、操作方便快捷，具有非常廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于分子檢測診斷技術領域。更具體地，涉及一種腫瘤相關基因突變位點篩查方法。

背景技術

腫瘤是當今威脅人類健康的最大疾病，在中國腫瘤已經超過冠心病、腦中風，成為第一位死因。靶向藥物針對腫瘤特異性位點，通過在局部維持較高的濃度，提高針對腫瘤的特異性殺傷力，對正常組織細胞作用較小，避免了化療治療的副作用。靶向藥物與腫瘤基因突變存在關聯性，在選用靶向藥物治療之前，需要確認腫瘤的基因突變位點，用來指導、選擇靶向藥物，以及預知藥物是否有效。

目前腫瘤相關基因突變位點的檢測技術主要有Sanger測序法、熒光定量PCR法、Fish法、micro array等。傳統的基因突變檢測方法因技術單次只能檢測較少的突變位點、靈敏度低。如Sanger測序法靈敏度低，僅能檢測突變率大于20％的高頻突變，假陰性率較高，且該技術手段難以勝任多基因多位點的檢測，操作繁瑣。而聚合酶鏈反應(PCR)：包括普通PCR、等位基因特異性PCR、實時熒光定量PCR、PCR-基因芯片技術等，主要缺點在于需要依賴PCR儀或昂貴的實時定量PCR儀，及其它多種配套設備，以及專門的PCR實驗室和專業操作人員。PCR檢測無法實現即時檢驗、床旁診斷和無特定實驗室檢測條件的場景應用，因此無法滿足基層、用戶終端、現場的檢驗需求。同時，PCR檢測可能存在假陽性和靈敏度不足等問題。

另外，CRISPR/Cas是進行基因編輯的強大工具，可以對基因進行定點的精確檢測與編輯。在向導RNA(guide RNA，gRNA)和Cas9蛋白的參與下，待編輯的細胞基因組DNA將被看作病毒或外源DNA，被精確剪切。但是，CRISPR/Cas9的應用也有一些限制條件，首先，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列(NGG)，其次向導RNA要與PAM上游的序列堿基互補配對，設計、制備出精確、特異性靶向目標基因的gRNA是CRISPR/Cas12a基因敲除的關鍵技術，等等。目前尚未有基于CRISPR/Cas12a系統的腫瘤相關突變基因檢測方法的相關報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有腫瘤相關基因突變位點檢測技術的缺陷和不足，設計、制備出精確、高效、特異性靶向目標基因的gRNA，這是CRISPR/Cas12a識別靶基因的關鍵；并基于此構建了一種基于CRISPR/Cas12a系統的腫瘤相關突變基因檢測方法及檢測試劑盒。

本發明的目的是提供一組基于CRISPR/Cas12a檢測腫瘤相關基因突變位點的gRNA組合。

本發明的另一目的是提供一種基于CRISPR/Cas12a的腫瘤相關基因突變位點檢測試劑盒。

本發明上述目的通過以下技術方案實現：

本發明提供了一種基于CRISPR/Cas12a的腫瘤相關基因突變位點檢測試劑盒，包括Cas12a蛋白和gRNA；所述gRNA以SEQ ID NO.1-35任一或任幾個所示靶標位點為靶序列進行設計得到。

所述gRNA的設計原則為：在選取gRNA靶向序列時，靶向序列5’端應具有5’-TTTN-3’序列，且靶向序列本身、靶向序列和其余序列間不形成穩定二級結構。

作為優選的可選擇方案，所述gRNA的序列如SEQ ID NO.36-71任一或任幾個所示。該gRNA組合也應在本發明的保護范圍之內。