[發明專利]用于敲除RBP4基因的sgRNA、RBP4基因缺失細胞株的構建方法及應用

有效

• 申請號: 201910352152.0
• 申請日: 2019-04-29
• 公開（公告）號: CN110229816B
• 公開（公告）日: 2023-06-06
• 發明（設計）人: 王慶;王飛;李若碧;昌沖;夏敏
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;C12N15/867;C12N9/22;C12N5/10
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 陳歡

本發明提供了一種用于敲除RBP4基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列為SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3所示序列中的至少一條。本發明還提供了一種敲除人肝癌細胞RBP4基因的方法，為利用CRISPR/Cas系統在人肝癌細胞中對RBP4基因進行改造。本發明還提供了一種RBP4基因缺失細胞株，RBP4是一種新型脂肪因子，具有干擾糖脂代謝的功能，還能負性調節胰島素信號通路進而引起胰島素抵抗的發生。本發明提供的RBP4基因敲除細胞株為研究RBP4基因提供了有效的平臺，有望為糖尿病、代謝綜合癥、肥胖等疾病的治療提供新靶點。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種用于敲除RBP4基因的sgRNA序列、RBP4基因缺失細胞株的構建方法及其應用。

背景技術

CRISPR/Cas9系統是一種后天免疫防御系統，用以保護細菌或古細菌免受外來質?；蚴删w的侵入，這類細菌或古細菌基因組的CRISPR序列能表達與入侵者基因組序列相識別的RNA，在CRISPR相關酶(CAS9)的作用下切割外源基因組DNA，達到抵制入侵的目的，經過人為改造后，CRISPR/Cas9系統可以實現在真核細胞中高度靈活且特異的基因組編輯，是目前基因組編輯領域最受歡迎的新一代基因組編輯技術，目前該技術已被用于構建各類基因敲除細胞系和基因敲除動物模型。

現有實驗技術中，與CRISPR/Cas9系統最為相似的是siRNA靶向的基因沉默技術。siRNA是指生物在進化過程中高度保守的雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其影響生物體一系列過程和功能，但在藥物等的誘導作用下，被沉默的基因會出現表達回復的現象。與siRNA靶向mRNA抑制基因表達相比，CRISPR/Cas9系統在基因組水平進行基因編輯，可以完全沉默基因的表達，構建真正的基因缺陷型細胞株。

視黃醇結合蛋白4(RBP4)是視黃醇、維生素A等的特異性運載蛋白。RBP4是一種新型脂肪因子，具有干擾糖脂代謝的功能，還能負性調節胰島素信號通路進而引起胰島素抵抗的發生。RBP4基因位于染色體10q23～q24區域，該區域的基因大都與2型糖尿病的發生發展有關。研究RBP4基因有望為糖尿病、代謝綜合癥、肥胖等疾病的治療提供新靶點。

因此有必要研制一種能實現沉默徹底且能長期穩定體外培養的RBP4基因缺失細胞株，期望通過研究RBP4基因缺失細胞株為糖尿病、代謝綜合癥、肥胖等疾病的治療提供新靶點。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了用于敲除RBP4基因的sgRNA序列、RBP4基因缺失細胞株的構建方法及其應用。

本發明第一方面提供一種用于敲除RBP4基因的sgRNA序列，所述sgRNA的靶DNA序列為SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:2、SEQ?ID?NO:3所示序列中的至少一條。

本發明第二方面提供一種敲除RBP4基因的方法，為利用CRISPR/Cas系統在人肝癌細胞中對RBP4基因進行改造，具體包括如下步驟：

1)人工合成如本發明第一方面所述靶DNA序列及其互補鏈；

2)將所合成的核酸片段插入到sgRNA骨架表達質粒載體的多克隆位點并轉化，挑單克隆菌株，提取sgRNA重組質粒，測序鑒定獲得測序正確的sgRNA重組質粒；其中，sgRNA骨架表達質粒載體還表達Cas9核酸酶；

3)將sgRNA重組質粒轉染人肝癌細胞，即得敲除RBP4基因的人肝癌細胞。

在本發明一實施例中，所述步驟2)具體包括：將所合成的SEQ?ID?NO:1、SEQ?IDNO:2及SEQ?ID?NO:3所示序列的核酸對分別插入到sgRNA骨架表達質粒載體的多克隆位點并轉化，挑單克隆菌株，提取sgRNA重組質粒，測序鑒定獲得測序正確的sgRNA重組質粒；其中，sgRNA骨架表達質粒載體還表達Cas9核酸酶；