[發明專利]復雜樣本的蛋白檢測方法

有效

• 申請號: 201910351754.4
• 申請日: 2019-04-28
• 公開（公告）號: CN110133170B
• 公開（公告）日: 2022-01-07
• 發明（設計）人: 秦鈞;汪宜;丁琛;李愷;宋雷;石文昊;劉明偉
• 申請（專利權）人: 北京谷海天目生物醫學科技有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88;G01N30/06
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 路秀麗

本發明提供了一種復雜樣本的蛋白檢測方法，該方法包括：對復雜樣本進行色譜分離以及質譜掃描采集質譜數據，在質譜掃描采集質譜數據的過程中，采用DDA模式掃描采集的過程中穿插PRM模式的掃描采集；對質譜數據中的蛋白進行定性和定量分析，獲得復雜樣本的全譜蛋白的表達信息。通過對現有的兩種質譜數據的采集模式進行調整，在DDA采集過程中穿插PRM采集模式對目標蛋白進行更準確地定量，在較短的時間范圍內既獲得了此類樣本的全譜蛋白表達情況，也獲得了目標蛋白的更準確的定量。該方法兼顧了DDA采集模式下蛋白全譜覆蓋的高通量和PRM采集模式下靶向定量的高靈敏度和精確度的優點，且操作簡單、耗時少、實驗周期短。

技術領域

本發明涉及蛋白表達量檢測領域，具體而言，涉及一種復雜樣本的蛋白檢測方法。

背景技術

數據依賴性采集(Data Dependent acquisition，DDA)是目前最常用的質譜數據采集模式，無需預先設定離子信息、或建立譜圖數據集，應用過程方便快捷。根據檢測樣本的實時信號強度對不同的離子進行碎裂掃描，能夠在一定程度上保證檢測樣本中離子種類的完整性。但根據實時信號強度進行離子采集，使得一些豐度較低的離子在定量過程中出現可信度偏低或丟失的現象。

平行反應監測(Parallel reaction monitoring，PRM)屬于質譜靶向分析，在整個液相分離過程中會不斷地對每一個目標母離子的全部碎片離子圖譜進行記錄。相比于傳統SRM只檢測目標離子對的模式，PRM檢測所選擇的母離子窗口內的所有碎片信息。PRM主要的優勢就是使用了超高分辨率的Orbitrap質量分析器，其能夠將干擾信息與真實的信號進行區分，以及相比于傳統的SRM方法能夠更好的保證分析的選擇性。但目前還無法在較短時間內完成上千個蛋白質的靶向檢測工作。

目前，針對組織、細胞以及體液等復雜樣本中蛋白復雜度較高，同時該樣本中的目的肽段豐度較低的情況下，想要快速高效地獲得此類樣本的全譜蛋白的表達量數據，仍無有效的解決方案。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種含復雜蛋白的樣本的蛋白檢測方法，以解決現有技術中無法在較短時間內完成復雜樣本中全譜蛋白表達檢測的問題。

為了實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種復雜樣本的蛋白檢測方法，該方法包括：對復雜樣本進行色譜分離以及質譜掃描采集質譜數據，其中，在質譜掃描采集質譜數據的過程中，采用DDA模式掃描采集的過程中穿插PRM模式的掃描采集；對質譜數據中的蛋白進行定性和定量分析，獲得復雜樣本的全譜蛋白的表達信息。

進一步地，在復雜樣本中，目標蛋白的靶向肽段所對應的時間窗口進行PRM模式的掃描采集；優選地，采用四級桿質譜儀或三合一質譜儀進行DDA模式掃描和PRM模式的掃描采集。

進一步地，對質譜數據中的蛋白定量進行分析的步驟包括：利用DDA模式采集的質譜數據根據一級色譜峰面積進行定量分析；利用PRM模式采集的質譜數據根據靶向肽段的中前三高的二級碎片離子的加和進行定量分析。

進一步地，采用色譜分析柱對復雜樣本進行色譜分離，其中色譜分析柱包括：色譜柱管，色譜柱管的外徑為355～365μm，內徑為100～200μm；填充于色譜柱管內的填料，填料為C18填料；以及與色譜柱管一體化設計的色譜柱尖。

進一步地，色譜柱管的長度為150～300mm。

進一步地，色譜柱尖的內徑(指色譜柱尖的最尖端位置的內徑)為2～8μm，優選為3～6μm；優選地，填料的粒徑為1.5～3μm，優選為1.8～2.5μm。

進一步地，色譜分離的步驟中，采用75～150min的色譜分離梯度進行分離。

進一步地，復雜樣本為組織樣本、細胞樣本或者體液樣本。

進一步地，復雜樣本為植物樣本、動物樣本或微生物樣本。