[發明專利]用于三陰性乳腺癌靶向治療的RNA三螺旋水凝膠的制備方法

有效

• 申請號: 201910346420.8
• 申請日: 2019-04-26
• 公開（公告）號: CN110038025B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發明（設計）人: 李雪梅;丁來榮;趙飛浪;張書圣
• 申請（專利權）人: 臨沂大學
• 主分類號: A61K31/7105
• 分類號: A61K31/7105;A61K9/06;A61K48/00;A61P15/14;A61P35/00;C12N15/10
• 代理公司: 成都方圓聿聯專利代理事務所(普通合伙) 51241
• 代理人: 曹少華

1.用于三陰性乳腺癌靶向治療的RNA三螺旋水凝膠的制備方法，其特征在于：首先設計直鏈DNA轉錄模板，通過滾環轉錄的方式形成純RNA體系的水凝膠，直鏈DNA中設計了CXCR4序列的反義序列及后面搭載兩種治療基因的三螺旋反義序列，在轉錄復制過程中產生治療型基因CXCR4，然后將另外兩種治療型microRNA及靶向MDA-MB-231細胞的核酸適體通過Waston-Crick和Hoogsteen堿基互補配對原則雜交，離心形成RNA三螺旋水凝膠納米結構；

所述直鏈DNA轉錄模板的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，且5’端磷酸化，所述另外兩種治療型microRNA為腫瘤抑制的microRNA和oncomiR抑制劑，核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，且它們的5’端具有FAM基團；所述靶向MDA-MB-231細胞的核酸適體為Fam-LXLapt-DNA-Chol，其為SEQ ID No.4所示的核苷酸序列且5’端修飾有Fam基團、3’端修飾有膽固醇；

具體步驟如下：

（1）取SEQ ID No.1所示且5’端磷酸化的直鏈DNA模板與T7啟動子以相同濃度進行退火處理；

（2）加入T4連接酶及T4連接酶緩沖液，16℃維持12 h，形成RNA轉錄模板；

（3）加入T7聚合酶，rNTP，T7聚合酶緩沖液及TEM 緩沖液在37℃下維持4 h，形成多副本的RNA水凝膠載體；

（4）將步驟（3）得到的RNA水凝膠載體、TEM緩沖液、兩條治療型microRNA、及靶向MDA-MB-231細胞的核酸適體在65℃下維持5 min，緩慢降至25℃，在4℃冰箱中放置2 h，10000rpm離心，形成最終RNA三螺旋水凝膠。

2.根據權利要求1所述的用于三陰性乳腺癌靶向治療的RNA三螺旋水凝膠的制備方法，其特征在于：所述退火處理的方法為：在TEM 緩沖液中加熱至95℃維持5 min，隨即1℃/min冷卻至25℃，維持30 min。

3.根據權利要求1或2所述的用于三陰性乳腺癌靶向治療的RNA三螺旋水凝膠的制備方法，其特征在于：TEM緩沖溶液組成為：1 mM精胺，10.8 mM MgCl₂，10 mM Tris-HCl，pH=8.0。

4.根據權利要求1-2任一項所述的制備方法制備的RNA三螺旋水凝膠在制備三陰性乳腺癌靶向治療藥物上的應用。