[發明專利]一種生物制劑中宿主殘留rDNA的去除方法

在審

• 申請號: 201910341738.7
• 申請日: 2019-04-25
• 公開（公告）號: CN111849962A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 楊宏宇;王海燕;張廣民;蔡輝益
• 申請（專利權）人: 北京挑戰農業科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京華仁聯合知識產權代理有限公司 11588
• 代理人: 蘇雪雪

一種酶制劑等生物制品中宿主殘留DNA的去除方法，屬于基因工程及酶制劑研究領域，本發明應用超濾、絮凝、魚精蛋白處理、核酸酶降解及噴霧干燥等技術針對發酵液中rDNA對其進行處理。利用該技術最優條件下可將生物制劑中rDNA含量降至10ng/g以下。

技術領域

一種生物制劑中宿主殘留rDNA的去除技術。所述的宿主為基因工程菌，屬于生物工程領域。

背景技術

伴隨著生物技術的發展，酶制劑、氨基酸、維生素等生物制品在食品、醫藥、農牧行業的應用日益增加。目前除木瓜蛋白酶等少數酶制劑是由動植物組織中直接提取之外，常見的酶制劑均由微生物培養獲得，如飼用酶制劑的主要生產菌株即為利用基因重組技術構建的工程菌，而在氨基酸、維生素等大宗生物制品的生產中，多數也利用發酵法進行制備。盡管利用轉基因技術能大幅度提高生產水平，但宿主細胞殘留DNA卻因為具有特別的潛在安全風險，一直是國內外監管機構關注的重點。如歐盟遵循“預防原則”，認為轉基因技術存在著潛在風險，因此歐洲食品安全局(EFSA)規定出口至歐盟的生物制劑中重組DNA(rDNA)含量不得高于10ng/g。隨著行業發展，人們對于轉基因技術生產的產品中rDNA關注度日益增強，未來國家關于轉基因技術的管控會愈加嚴格，因此本技術在生物產業的良性發展及降低轉基因產品安全風險等方面均具有良好的應用前景。

目前國外生物制劑中rDNA去除技術主要依托不同孔徑的濾膜過濾、絮凝、結晶等分離技術來降低產品中的rDNA含量，但由于酵母等高密度發酵的酶液含菌量高，且雜質較多，因此對濾膜等分離設備要求較高，且依靠單一的超濾技術不僅提高了生產成本，還會降低產品收率。國內目前關于酶制劑中rDNA含量暫無規范，在醫藥領域中rDNA主要依靠層析等技術去除，后處理成本高昂，不適用于工業化制備。未來低rDNA生物制品制備技術的發展將集中于不同分離技術與核酸酶降解技術的集成。

發明內容

本發明的目的是提供一種降低酶制劑等生物制品中rDNA含量的方法；本發明提供生物產品或發酵液中rDNA的提取及檢測方法以及酶制劑中rDNA的去除方法。

本發明要解決的第一個技術問題，是提供一種生物制品中微量DNA的提取及檢測方法。所述提取方法為碘化鈉提取法，即利用高濃度的促溶劑碘化鈉使蛋白質溶解，然后加入異丙醇，并利用糖原和核酸共沉淀，從而特異性的使DNA沉淀抽提出來，提取率可達80％以上。

rDNA的檢測使用熒光法，即利用標準DNA濃度與相應的熒光值建立標準曲線，并取一定量提取的待測DNA與熒光染料結合，根據熒光值計算得出樣品的DNA含量，每組設2個平行。

本發明要解決的第二個技術問題，是提供一種生物制品中rDNA的去除方法。主要包括以下步驟：

1)測定表達菌株在不同培養時間上清液中的DNA含量，在一個優選的實施例中，酵母培養物前150h，其上清液DNA含量低于100ng/mL，而在150h之后，大量產酶細胞自溶凋亡，上清液中DNA含量迅速上升，184h時胞外DNA含量為544ng/mL。

2)先后利用板框及微濾膜對發酵液進行過濾除菌，對于含菌量較高的發酵液可進行多次過濾。

3)在發酵液上清中添加0.01％-2％的絮凝劑，絮凝劑可以是堿式氯化鋁或聚合硫酸鐵，并根據目的酶的耐熱穩定性將溫度控制在50-70℃之間，在一個優選的實施例中，將溫度控制在70℃處理6h，不僅可將rDNA含量由424ng/mL降低至139ng/mL，還可以去除大量的雜蛋白并降低上清液粘度。

4)利用微濾膜對上述處理液進行二次過濾后，根據目的酶分子量選擇孔徑低于蛋白分子量的超濾膜對上清液進行超濾濃縮，在一個優選的實施例中選擇30kDa濾膜對植酸酶發酵液進行濃縮，酶活收率可達85％，濃縮倍數6.5倍。