[發明專利]一種呼吸道合胞病毒融合前F蛋白及其應用

有效

• 申請號: 201910337141.5
• 申請日: 2019-04-25
• 公開（公告）號: CN110054668B
• 公開（公告）日: 2021-09-10
• 發明（設計）人: 何金生;馬堯;付遠輝;彭向雷;鄭妍鵬
• 申請（專利權）人: 北京交通大學
• 主分類號: C07K14/135
• 分類號: C07K14/135;C12N15/45;G01N33/68;G01N33/569;C07K16/10;A61K39/155;A61P31/14
• 代理公司: 北京市商泰律師事務所 11255
• 代理人: 鄒芳德

本發明提供了一種呼吸道合胞病毒融合前F蛋白及其應用，屬于呼吸道合胞病毒疫苗技術領域。該融合前F蛋白是野生型F蛋白的第106位、第108位及第109位氨基酸由Arg突變為Asn后，第104位氨基酸由Asn突變為Cys、第155位氨基酸由Ser突變為Cys，或者第58位氨基酸由Thr突變為Cys、第190位氨基酸由Ser突變為Cys。本發明突變野生型F蛋白的第一個弗林酶切割位點，使Pre?F的結構更加穩定，表達量沒有下降且M1?F在293T細胞中表達的融合前表位顯著提高；對F蛋白氨基酸位點的第二次突變，使其形成二硫鍵，與野生型相比具有更穩定的融合前表位，適用于人RSV的其他病毒株；適用于以RSV F蛋白為抗原的各種疫苗形式，如：核酸疫苗、蛋白疫苗、載體疫苗及重組病毒顆粒疫苗。

技術領域

本發明涉及呼吸道合胞病毒疫苗技術領域，具體涉及一種呼吸道合胞病毒融合前F蛋白及其應用。

背景技術

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)是一種有包膜的、非節段的、單股負鏈RNA病毒，屬于肺病毒科(Pneumoviridae family)，其能夠引起嬰幼兒及老年人嚴重下呼吸道感染。全球5歲以下兒童每年因RSV導致嚴重下呼吸道感染人數為3千萬人，死亡人數達到6萬人以上。在1月齡至1周歲嬰幼兒的全因死亡人口中，RSV感染導致的死亡人數占6.7％。100％的嬰幼兒在3歲以內至少感染過1次RSV病毒，感染高峰出現在2至4月齡。5歲以下兒童都存在感染RSV導致嚴重疾病的風險，并且該病毒存在反復感染的情況。盡管，從1956年起，RSV已經被廣泛認識，但到目前為止尚無能夠有效抵抗RSV感染的疫苗問世。

RSV病毒的融合糖蛋白(fusion glycoprotein，F)為包膜蛋白，具有黏附功能與融合功能。同時，F蛋白因其能夠產生高效的中和抗體，以及它在不同RSV病毒株之間的高度保守性，被用作RSV疫苗研發的主要候選抗原。

F蛋白屬于I型整合膜蛋白，由574個氨基酸組成其無活性前體(F0)。三個F0形成三聚體，在運輸通過高爾基體時，宿主的弗林蛋白酶在F0的第109與110位氨基酸之間及136與137位氨基酸之間進行切割。切割后，中間27個氨基酸的短肽(P27)被釋放，而其余兩段F2及F1通過二硫鍵連接(Cys69–Cys212和Cys37–Cys439)形成成熟的F蛋白結構。在F1蛋白N末端存在有一段高疏水性的融合肽(fusion peptide,FP)，其位于蛋白的疏水腔中而免受外部親水環境的影響。當F蛋白出現在病毒體表面或細胞表面時，它的結構并不穩定，而是處于一種高能級亞穩態的Pre-F結構。隨后，F1蛋白的N末端經歷了一系列劇烈的結構變化，這個過程誘導了膜融合的發生，從而達到了病毒感染細胞的目的。同時，該過程還導致了F蛋白由高能級亞穩態的Pre-F結構轉變為穩定的融合后F蛋白結構(postfusion glyprotein,Post-F)。

McLellan等人最先研究出了Pre-F蛋白的結構。他們通過對F蛋白第155位和290位氨基酸突變(S155C和S290C)形成二硫鍵，190位和207位氨基酸的突變(S190F和V207L)維持結構的穩定，及在F1的C末端，用一段T4噬菌體纖維蛋白三聚結構域替換F蛋白的跨膜區與胞內區，由此純化出了穩定的融合前F蛋白三聚體，命名為DS-Cav1。目前的研究顯示，融合前F含有兩個融合前特有的表位(和Site V)。這兩個表位產生的中和抗體與融合前F、融合后F均含有的四個表位(Site I、Site II、Site III和Site IV)相比中和活性顯著增強。所以，以F蛋白為主要保護性抗原的RSV疫苗研究關鍵在于，如何維持F蛋白融合前結構的穩定性，以增強高效中和抗體的產生。

發明內容

本發明的目的在于提供一種融合前表位顯著提高且具有熱穩定性的呼吸道合胞病毒融合前F蛋白突變體，以解決上述背景技術中存在的技術問題。

為了實現上述目的，本發明采取了如下技術方案：