[發明專利]一種從糞菌中制備乳酸菌液的方法及其應用

有效

• 申請號: 201910331436.1
• 申請日: 2019-04-24
• 公開（公告）號: CN109943487B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發明（設計）人: 桑艷玲;王希輝;李相釗;王菲;劉少寧
• 申請（專利權）人: 桑艷玲
• 主分類號: C12N1/02
• 分類號: C12N1/02;C12Q1/6869;C12Q1/04
• 代理公司: 北京首捷專利代理有限公司 11873
• 代理人: 梁婧宇

本發明公開了一種從糞菌中制備乳酸菌液的方法及其應用，屬于生物工程技術領域；從糞菌中制備乳酸菌液的方法包括以下步驟：乳酸菌的篩選與鑒定；乳酸菌液的制備；乳酸菌的篩選與鑒定包括選擇供體，通過供體糞便進行乳酸菌的培養篩選和基因測序；本發明通過選擇小豬作為供體，在制備乳酸菌液時對其糞便進行篩選鑒定，降低了糞菌中有害菌存在的潛在風險；固體培養基使用香蕉泥和干柚皮粉作為培養基組分，增加了乳酸菌的生長種類及數量；液體培養基使用腐植酸鈉和羧甲基纖維素鈉作為培養基懸浮載體，提高了營養成分的利用效率，延長了糞乳酸菌的生長周期；制備的乳酸菌液可以在動物生長前期提前干預其腸道菌群形成來降低幼齡動物腹瀉率，提高動物生長性能。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體是一種從糞菌中制備乳酸菌液的方法。

背景技術

糞菌移植（FMT，fecal?microbiota?transplantation），是一種重塑腸道菌群的方法，是治療腸道菌群紊亂導致疾病的重要手段。治療時將健康者糞樣中的功能菌群移植到患病者胃腸道內，重新組建具有正常功能的腸道菌群，從而治療腸道及腸道外疾病。FMT在人類醫學史上至少已有1700年的醫學記載。中國傳統醫學一直有用人大小便給人治病的記載。公元300-400年間，東晉時期葛洪《肘后備急方》即有記載，用人糞清治療食物中毒、腹瀉、發熱并瀕臨死亡的患者。現代醫學史上，最早的糞菌移植報道于1958年，美國外科醫生Ben?Eiseman等對患有嚴重偽膜性腸炎的4名患者實施糞便移植，結果其中3名垂危的患者都在幾天之內奇跡般康復出院了，而另1名患者死于與腸道疾病無關的其他疾病。然而，在之后的20年里，幾乎沒引起人重視。直至1981年，Bowden?等報道用經小腸置管輸入糞液的方法，成功治愈16例偽膜性腸炎患者。2013年，FMT被納入治療復發性艱難梭菌感染（CDI）的指南，其治療CDI的一次治愈率達81%?；贔MT的臨床療效，醫學研究者需要反思現代生命科學某些研究思維存在的局限性，所幸的是，研究者已經從重視特定細菌開始向重視整體菌群轉變，這是微生物與疾病關系研究領域在近二十年的重要認識突破。

進行糞菌移植前需要從糞菌中篩選合適的有益菌制備成可使用的乳酸菌液，現有的制備方法復雜，制備的菌液樣本未經篩選，存在將致病微生物引入受體的風險。

發明內容

本發明的目的在于提供一種從糞菌中制備乳酸菌液的方法，以解決上述背景技術中提出的問題。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種從糞菌中制備乳酸菌液的方法，包括以下步驟：

步驟一、乳酸菌的篩選與鑒定；

步驟二、乳酸菌液的制備；

所述篩選與鑒定包括以下步驟：

（1）選擇健康供體；

（2）取供體糞便，加入無菌生理鹽水密封，放入搖床使其充分混勻，然后取自然沉淀上清液加入到裝有固體培養基的平板中，采用平板傾注法培養乳酸菌，待凝結后倒置放入厭氧培養箱中培養；

（3）選取總數為100-300個菌落，并且具有3-5個類似乳酸菌菌落的平板，用接種環將類似乳酸菌菌落接種到三角瓶中，在厭氧培養箱中靜止培養后取每個菌株培養液送檢進行16S?rRNA基因測序，然后確定乳酸菌的種類。

作為本發明進一步的方案：所述步驟（1）中供體為60日齡的豬，該豬飼養過程中從未得過細菌病、病毒病及寄生蟲病，從未腹瀉，未使用抗生素。

作為本發明進一步的方案：所述步驟（2）中取供體糞便，加入糞便重量2倍的無菌生理鹽水進行密封，放入35-40℃搖床，在150-200rpm的搖床中搖晃5-15min，使其充分混勻，然后取1ml自然沉淀上清液加入到裝有固體培養基的平板中，采用平板傾注法培養乳酸菌，待凝結后倒置放入35-40℃厭氧培養箱中培養40-50h。