[發明專利]無Sf-RV污染的Sf9細胞株及其篩選方法和應用

在審

• 申請號: 201910317758.0
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110423726A
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 楊屹;苗麗;侯玉婷;劉發明;吳海華;朱蕾;宋立強
• 申請（專利權）人: 長春卓誼生物股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/866
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

本發明涉及昆蟲細胞系，公開了一株無Sf?RV污染的Sf9細胞株及其篩選方法和應用。該細胞株是從商業來源Sf9細胞篩選得到，命名為Sf9?ZY細胞株，其生物保藏號為CCTCC NO:C201952。桿狀病毒在Sf9?ZY細胞株增殖水平和蛋白表達量檢測表明，Sf9?ZY細胞株可替代Sf9細胞作為昆蟲細胞?桿狀病毒表達載體系統(BICS)的宿主細胞，應用于表達重組蛋白制備生物制品。本發明提供的Sf9?ZY細胞株解決了昆蟲細胞?桿狀病毒表達載體系統(BICS)的宿主細胞污染Sf?RV病毒問題，保證了生物制品的安全性。

技術領域

本發明涉及昆蟲細胞系，具體涉及一株無Sf-RV污染的Sf9細胞株及其篩選方法和應用。

背景技術

在1969年Vaughn等建立了昆蟲細胞系，分離于雌性草地夜蛾蛹的卵巢組織，當時的培養基中補加2.6％的熱滅活的昆蟲血，建立后，這個細胞系提供給了英國牛津大學的NERC無脊椎動物病毒學部，在那里這個細胞系被適應到了補加新生牛血清的培養基中，從而取代了補加昆蟲血的培養基，此時的細胞株稱為IPLB-Sf-21-AE，后來又提供給了美國德克薩斯A&M大學，在那里被克隆化，應用于蛋白表達體系。Sf9細胞株是由G.E.Smith和C.L.Cherry從IPLB-Sf-21-AE克隆而來，細胞形態更加均一，對多角病毒敏感，適用于分泌蛋白的表達，而且采用無血清培養基生長良好。

但2014年Ma和他的同事發現，每個Sf細胞系，包括兩個商業來源Sf21和Sf9細胞，被污染了一種新的彈狀病毒Sf-rhabdovirus(Sf-RV)，這對基因工程疫苗和抗體生產帶來的安全性威脅。對Invitrogen公司來源的Sf9細胞進行Sf-RV檢測，結果表明也污染了這種病毒。

昆蟲細胞-桿狀病毒表達載體系統(BICS)是基因工程四大表達系統之一，是一個以桿狀病毒為外源基因載體，以昆蟲細胞為受體的表達系統，它具有安全、高效、容量大、重組病毒易于篩選、表達產物能進行折疊和修飾具有生物活性，等特點，它是一種真核表達系統，具有重組蛋白表達量高，能夠在一個載體上表達多種蛋白，容納較大片段的外源DNA插入，細胞培養易于大規模獲得蛋白等特點，在基因工程疫苗和抗體方面具有廣闊的應用前景，廣泛的應用于生物制品的生產。

然而，在Sf細胞系中發現的新彈狀病毒(Sf-RV)引起了人們對昆蟲細胞-桿狀病毒表達載體系統生產的生物制劑安全性的擔憂。雖然截止目前，并沒有證據表明Sf-RV病毒對人類或動物構成威脅，然而，在生物制品制備過程中一旦發現了任何外源病毒污染，都必須采取一切辦法將它去除，保證生物制品的安全性。

本發明對無Sf-RV病毒的Sf9細胞株的研究屬于首次。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供一株無Sf-RV污染的Sf9細胞株及其篩選方法和應用。

本發明第一方面提供一株無Sf-RV污染的Sf9細胞株，其生物保藏編號為CCTCCNO:C201952，命名為Sf9-ZY細胞株。

本發明第二方面提供一種上述無Sf-RV污染的Sf9細胞株的篩選方法，具體技術方案如下：

(1)制備單細胞懸液：將商業來源的Sf9細胞在無血清昆蟲細胞培養基(Gibco Sf-900ⅢSFM)于27℃恒溫培養箱中靜止培養傳代1代后，采用傳代培養2-3天的Sf9細胞或細胞融合度大于95％時，加入無血清Gibco Sf-900ⅢSFM培養基5ml，輕輕吹打瓶底細胞，制備細胞懸液，采用自動細胞計數儀，對細胞懸液進行計數，保證細胞活率在98％以上；