[發明專利]無Sf-RV污染的Sf9細胞株及其篩選方法和應用

在審

• 申請號: 201910317758.0
• 申請日: 2019-04-19
• 公開（公告）號: CN110423726A
• 公開（公告）日: 2019-11-08
• 發明（設計）人: 楊屹;苗麗;侯玉婷;劉發明;吳海華;朱蕾;宋立強
• 申請（專利權）人: 長春卓誼生物股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/866
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一株無Sf-RV污染的Sf9細胞株，其特征在于：其生物保藏號為CCTCC NO:C201952，命名為Sf9-ZY細胞株。

2.一種如權利要求1所述的無Sf-RV污染的Sf9細胞株的篩選方法，其特征在于：通過以下方法篩選得到：

(1)制備單細胞懸液：將Sf9細胞在無血清Gibco Sf-900ⅢSFM培養基于27℃培養箱培養中傳代1代后，采用傳代培養2-3天的Sf9細胞或細胞融合度大于95％時，加入無血清Gibco Sf-900ⅢSFM培養基5ml，輕吹打瓶底細胞，制備細胞懸液，采用自動細胞計數儀，對細胞懸液進行計數，保證細胞活率在98％以上；

(2)細胞懸液稀釋：取Gibco Sf-900ⅢSFM培養基，補加2％小牛血清，將細胞懸液稀釋至1×10⁵個/ml后，經1:100(v/v)、1:1000(v/v)、1:10000(v/v)系列稀釋，至每毫升10個細胞，分別選1×10³個/ml、1×10²個/ml、1×10個/ml細胞，接種96孔板，每孔種0.1ml，用封口膜將96孔板封口，掃描拍照后，置27℃恒溫培養箱中靜止培養；

(3)細胞培養：每間隔2～3天將96孔板掃描拍照，觀察集落形成情況，每7天更換補加2％小牛血清的Gibco Sf-900ⅢSFM培養基，培養直至第28天；

(4)細胞傳代：取上述步驟(3)中96孔板中有單個集落生長的孔，用微量移液器將集落細胞輕輕吹打，原孔培養，置27℃恒溫培養箱中靜止培養；

(5)6孔板傳代：取上述步驟(4)中傳代培養3～4天細胞，用微量移液器輕輕吹打成細胞懸液，將細胞懸液轉移至6孔板，每孔補加2ml Gibco Sf-900ⅢSFM培養基，置27℃恒溫培養箱中靜止培養；

(6)細胞培養、傳代擴增及凍存：取上述6孔板中傳代培養3～4天細胞，用微量移液器輕輕吹打成細胞懸液，轉至25cm²細胞培養瓶，每孔細胞懸液補加3ml Gibco Sf-900ⅢSFM培養基，置27℃恒溫培養箱中靜止培養；將培養3～4天的25cm²細胞培養瓶中細胞，輕輕吹打下來，轉移至50ml轉瓶中，接種密度為5×10⁵個/ml，置27℃恒溫培養箱中轉動培養，轉速為100～120rpm；取轉瓶培養的細胞，用自動細胞計數儀計數，測定細胞活率，保證活率大于90％，將細胞800rpm室溫離心5分鐘，用細胞凍存液重懸細胞沉淀，細胞密度在1×10⁷個/ml，分裝至凍存管，梯度降溫后，移至液氮罐長期保存；

(7)篩選出的細胞株命名為Sf9-ZY細胞株，建立三級細胞庫。

3.根據權利要求1所述的無Sf-RV污染的Sf9細胞株在昆蟲細胞-桿狀病毒表達載體系統中的應用。