[發(fā)明專利]一種由功能肽A25修飾的基因載體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910302305.0
• 申請(qǐng)日: 2019-04-16
• 公開（公告）號(hào): CN110004180B
• 公開（公告）日: 2023-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉克海;張庭瑞;方舟;韓萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/87
• 分類號(hào): C12N15/87;C07K14/00;C07K1/107
• 代理公司: 上海卓陽(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31262
• 代理人: 周春洪

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體公開一種由功能肽A25修飾的基因載體及其制備方法和應(yīng)用。所述基因載體為功能肽A25與聚乙烯亞胺形成的偶聯(lián)物；所述聚乙烯亞胺的分子量為500?2000Da；所述功能肽A25與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:1?5。本發(fā)明將Angiopep?2肽與核定位信號(hào)肽NLS連接，合成具有靶向于LRP受體和可以提高核遞送能力的含Angiopep?2和NLS雙功能多肽A25；進(jìn)一步將其與低分子PEI偶聯(lián)，從而構(gòu)建新型非病毒基因載體系統(tǒng)，本發(fā)明的基因載體不僅具有低毒性的特點(diǎn)，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性，且可促進(jìn)載體細(xì)胞核遞送，可以更好的靶向腫瘤細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，增加載體的轉(zhuǎn)染效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種由功能肽A25修飾的基因載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

基因治療是近年來建立在基因工程技術(shù)和分子遺傳學(xué)原理基礎(chǔ)上的新型治療方法，因腫瘤發(fā)生與發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)是基因突變，所以基因治療現(xiàn)已成為攻克腫瘤最具希望的領(lǐng)域。基因治療現(xiàn)階段面臨的最大難題在于尚未找到理想的基因載體。

聚乙烯亞胺(polyethylenimine?PEI)是近年來研究最為廣泛的陽(yáng)離子多聚物非病毒基因載體，富含陽(yáng)離子，具有強(qiáng)大的緩沖能力，有較強(qiáng)結(jié)合DNA和黏附細(xì)胞的能力。然而，小分子PEI細(xì)胞毒性低，但轉(zhuǎn)染效率也低，大分子PEI轉(zhuǎn)染效率高，但高分子量PEI表現(xiàn)出較強(qiáng)細(xì)胞毒性。另外，由于聚乙烯亞胺是利用自身所帶的正電荷，與細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的受體通過靜電作用相結(jié)合，所以細(xì)胞的選擇特異性差。解決小分子PEI細(xì)胞毒性和靶向性問題已成為非病毒載體中最為關(guān)注的問題。因此，如何將PEI改造成靶向性強(qiáng)、轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低的基因載體材料是解決PEI應(yīng)用難題的突破口。

血腦屏障(blood?brain?bar?rier，BBB)是使腦內(nèi)環(huán)境保持平衡的一道具有選擇性阻礙作用的動(dòng)態(tài)界面，是藥物進(jìn)入腦內(nèi)的主要屏障。受體介導(dǎo)的胞吞轉(zhuǎn)運(yùn)是目前遞送藥物入腦最為成熟的腦靶向策略之一。BBB上有多種特異性受體，如胰島素受體、乳鐵蛋白受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、N-乙酰膽堿受體和低密度脂蛋白受體等。其中，在BBB和腦膠質(zhì)瘤上高表達(dá)的LRP-1受體，可將其作為基因治療的靶向點(diǎn)。

Angiopep-2(24KDa)是由19個(gè)氨基酸分子組成的新型，廣泛存在于生物體內(nèi)，它可通過BBB上表達(dá)的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)受體介導(dǎo)內(nèi)吞進(jìn)入腦組織，在腦實(shí)質(zhì)的分布容積是轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)的2.5倍。此外，Angiopep-2修飾的納米遞藥系統(tǒng)通過LRP介導(dǎo)顯著增加腦部的蓄積。研究表明，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞都表達(dá)LRP受體，這提示LRP可能成為腦膠質(zhì)瘤靶向遞藥的一個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。

NLS是核內(nèi)功能蛋白進(jìn)入細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，是介導(dǎo)某些蛋白入核的一段充分而必要的信息片段。NLS序列，可促進(jìn)大分子物質(zhì)入胞后的核遞送，尤其是體內(nèi)轉(zhuǎn)染時(shí)非分裂分化細(xì)胞的核遞送。這對(duì)克服細(xì)胞核膜屏障、提高體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率至關(guān)重要。

因此，理論上可將Angiopep-2多肽與核定位信號(hào)肽NLS連接，合成具有靶向于LRP和提高核遞送能力的含Angiopep-2和NLS雙功能多肽，用于修飾低分子PEI，增強(qiáng)其在體內(nèi)對(duì)腫瘤細(xì)胞選擇性，并提高核遞送能力，從而增加DNA的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率。

現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于雙功能肽(Angiopep-2和NLS)修飾的聚乙烯亞胺及其制備方法和應(yīng)用還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種基于PEI的轉(zhuǎn)染效率高、毒性低、靶向性強(qiáng)的基因載體材料。

本發(fā)明的第二個(gè)目的在于，提供如上所述功能肽A25修飾的PEI基因載體的制備方法。

本發(fā)明的第三個(gè)目的在于，提供如上所述基因載體的用途。

本發(fā)明的第四個(gè)目的在于，提供一種DNA復(fù)合物。

本發(fā)明的第五個(gè)目的在于，提供一種功能肽A25。