[發(fā)明專利]Y染色體微缺失檢測(cè)的擴(kuò)增組合物及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910301927.1
• 申請(qǐng)日: 2019-04-16
• 公開（公告）號(hào): CN109957616B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 智慧芳;佟洪梅;趙方圓;倪君君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京和合醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6883
• 分類號(hào): C12Q1/6883;C12Q1/6858
• 代理公司: 北京雙收知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 李厚銘

本發(fā)明公開了一種Y染色體微缺失檢測(cè)的擴(kuò)增組合物及試劑盒，利用用于擴(kuò)增6個(gè)STS位點(diǎn)(AZFa：sY84、sY86；AZFb：sY127、sY134；AZFc：sY254、sY255)和2個(gè)質(zhì)控位點(diǎn)(ZFX/ZFY、SRY)的引物，通過多重PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，檢測(cè)上述6個(gè)與Y染色體微缺失密切相關(guān)的STS位點(diǎn)，從而判斷Y染色體微缺失的情況。利用本發(fā)明的擴(kuò)增組合物，只需2管擴(kuò)增反應(yīng)就可同時(shí)對(duì)6個(gè)STS位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及染色體缺失檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種Y染色體微缺失檢測(cè)的擴(kuò)增組合物及試劑盒。

背景技術(shù)

Y染色體長(zhǎng)臂上存在著影響精子發(fā)生的無精子因子(AZF)區(qū)域，進(jìn)一步可分為AZFa,AZFb和AZFc三個(gè)區(qū)域。任何一個(gè)區(qū)域的微缺失都會(huì)導(dǎo)致男性生精障礙，引發(fā)少精子癥或無精子癥。在精子發(fā)生障礙引起的男性不育患者中，Y染色體微缺失的發(fā)生率僅次于Klinefelter’s syndrome(克氏綜合征)，是居于第二位的遺傳因素。Y染色體微缺失已成為男性不育患者的常規(guī)檢查項(xiàng)目。

AZF的3個(gè)區(qū)域中，每個(gè)區(qū)域均有明確的序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)，并且缺失斷裂位置均已明確。考慮到PCR擴(kuò)增影響因素眾多，為了增加檢測(cè)的可信度、提高靈敏度，歐洲男科學(xué)協(xié)會(huì)/歐洲分子遺傳質(zhì)量協(xié)作網(wǎng)(EAA/EMQN)聯(lián)合發(fā)布的1999版、2004版、2013版《Y染色體微缺失分子診斷實(shí)踐指南》中均推薦在每個(gè)AZF區(qū)域選擇2個(gè)STS：AZFa檢測(cè)sY84、sY86，AZFb檢測(cè)sY127、sY134，AZFc檢測(cè)sY254、sY255，每個(gè)區(qū)域2個(gè)STS均缺失才代表該區(qū)域缺失，并指出通過以上6個(gè)STS可以檢測(cè)出幾乎所有臨床相關(guān)的微缺失或95％文獻(xiàn)報(bào)道的AZF缺失，足以滿足常規(guī)診斷，而增加更多的位點(diǎn)或許有更多的科學(xué)發(fā)現(xiàn)，但其對(duì)臨床指導(dǎo)意義有待進(jìn)一步的探討。同時(shí)，指南推薦采用多重PCR聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳方法來檢測(cè)Y染色體微缺失，一般為2個(gè)多重PCR反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)分別檢測(cè)不同區(qū)域的3個(gè)STS。

多重PCR聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳是目前Y染色體微缺失應(yīng)用最為廣泛的方法，經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐證明該方法準(zhǔn)確、靈敏和易于操作，并且成本低廉，但是，該方法最大的困難和挑戰(zhàn)在多重PCR引物的設(shè)計(jì)：(1)準(zhǔn)確的定位STS位置設(shè)計(jì)引物，避免出現(xiàn)STS丟失現(xiàn)象；(2)引物設(shè)計(jì)科學(xué)合理，避免相互干擾；(3)擴(kuò)增片段之間大小差距必須達(dá)到50bp以上，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)才能進(jìn)行較好的區(qū)分及結(jié)果判讀。這些限制在很大程度上增加了引物設(shè)計(jì)的難度。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明通過對(duì)擴(kuò)增引物組合及擴(kuò)增體系和程序長(zhǎng)時(shí)間的摸索和優(yōu)化，并且經(jīng)過了大量的臨床樣本實(shí)驗(yàn)，最終開發(fā)出了一個(gè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠且經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的Y染色體微缺失檢測(cè)的擴(kuò)增組合物和試劑盒。

本發(fā)明利用用于擴(kuò)增6個(gè)STS位點(diǎn)(AZFa：sY84、sY86；AZFb：sY127、sY134；AZFc：sY254、sY255)和2個(gè)質(zhì)控位點(diǎn)(ZFX/ZFY、SRY)的引物，通過多重PCR結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，檢測(cè)上述6個(gè)與Y染色體微缺失密切相關(guān)的STS位點(diǎn)，從而判斷Y染色體微缺失的情況。利用本發(fā)明的引物和檢測(cè)體系，只需2管擴(kuò)增反應(yīng)就可同時(shí)對(duì)6個(gè)STS位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案具體如下：

一種Y染色體微缺失檢測(cè)的擴(kuò)增組合物，包括下列引物組合：

(1)用于擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)sY84位點(diǎn)的引物對(duì)，其堿基序列為：

sY84-F：5'-TTTCAGCAAAGAGAAGGGTCC-3'

sY84-R：5'-TCTGAAGCCTACTACCTGGAG-3'；如序列表中SEQ ID NO:1-2所示；

(2)用于擴(kuò)增Y染色體AZFa區(qū)sY86位點(diǎn)的引物對(duì)，其堿基序列為：

sY86-F：5'-GGGAGAAGACAGCATCTACAAC-3'