[發明專利]果糖基賴氨酸的測定方法

在審

• 申請號: 201910279861.0
• 申請日: 2019-04-09
• 公開（公告）號: CN110358807A
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 佐藤大祐;竹中涼
• 申請（專利權）人: 池田食研株式會社
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12N9/12;C12N9/96
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 苗堃;金世煜

本發明提供具有溫度和pH穩定性的FN6K和使用該FN6K的果糖基賴氨酸的測定方法，該測定方法的特征在于，使被檢試樣與具有以下的特性(a)～(f)的果糖胺?6?激酶反應。(a)在ATP存在下，將果糖基賴氨酸進行磷酸化而生成果糖基賴氨酸?6?磷酸；(b)比活性：10U/mg以上；(c)底物特異性：將對果糖基賴氨酸的反應性設為100％時，對果糖基纈氨酸的反應性為5％以下；(d)分子量：25kDa～35kDa；(e)pH穩定性：在6.5～8.0穩定；(f)溫度穩定性：在30℃穩定。

技術領域

本發明涉及果糖基賴氨酸的測定方法等。

背景技術

已知食品在加工、儲藏過程中，蛋白質、氨基酸與糖發生非酶反應(美拉德反應)而產生褐變。褐變不僅在食品的著色、香味、抗氧化能力的賦予等品質形成上發揮重要的作用，還與加熱時間、儲藏時間有關，因此也成為新鮮度、品質劣化的指標。

在美拉德反應的初期階段，在氨基酸的氨基與糖的羰基通過羰氨反應而形成席夫堿后，通過Amadori重排而產生穩定的Amadori化合物。例如，很多食品中含有的作為必需氨基酸之一的賴氨酸與食品中含有的糖反應而生成果糖基賴氨酸。另外認為由于賴氨酸不僅在α位，在ε位也具有氨基，因此在蛋白質結構中氨基大多以游離形態存在，容易發生羰氨反應。因此，食品中含有的果糖基賴氨酸量與褐變的進行度相關，其測定值可成為食品的品質管理的重要指標，因此確立測定法是有用的。

測定果糖基賴氨酸的方法已知有使用果糖胺-6-激酶(以下稱為FN6K)的方法。已知FN6K將ε位被糖化的果糖基賴氨酸(ε―FK)進行磷酸化而生成果糖基賴氨酸-6-磷酸。例如，報告有來自埃希菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節桿菌屬(Arthrobacter)的FN6K(非專利文獻1)。其中，來自芽孢桿菌屬的FN6K以ε-FK和α-果糖基纈氨酸(α-FV)這兩者為底物，因此底物特異性低。來自埃希菌屬、節桿菌屬的FN6K對ε-FK有特異性，但問題是前者的溫度穩定性差，后者的比活性低(非專利文獻2)。

現有技術文獻

非專利文獻

非專利文獻1：Biotechnology Journal 11(2016),797-804

非專利文獻2：Appl.Biochem.Biotechnol.170(2013)710-717

發明內容

本發明的課題在于提供溫度穩定性、pH穩定性和底物特異性優異的FN6K和使用該FN6K的果糖基賴氨酸的測定方法。

為了解決上述課題，本發明人等對自然界的FN6K的篩選進行了深入研究，結果從幾種菌株中發現了溫度穩定性和pH穩定性高的具有FN6K活性的酶。并且，通過使用這樣的酶，發現了溫度穩定性、pH穩定性和底物特異性優異的果糖基賴氨酸的測定方法，從而完成了本發明。

本發明涉及以下的[1]～[12]。

[1]一種果糖基賴氨酸的測定方法，其特征在于，使被檢試樣與具有以下的特性(a)～(f)的果糖胺-6-激酶反應。

(a)在ATP存在下，將果糖基賴氨酸進行磷酸化而生成果糖基賴氨酸-6-磷酸

(b)比活性：10U/mg以上

(c)底物特異性：將對ε-果糖基賴氨酸的反應性設為100％時，對果糖基纈氨酸的反應性為5％以下

(d)分子量：25kDa～35kDa

(e)pH穩定性：在6.5～8.0穩定

(f)溫度穩定性：在30℃穩定

[2]根據[1]所述的果糖基賴氨酸的測定方法，其中，果糖胺-6-激酶進一步具有以下的特性(g)和(h)。