[發(fā)明專(zhuān)利]一種高純度DNA模板的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910253729.2
• 申請(qǐng)日: 2019-03-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109811034A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-05-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊保偉;李怡讕;牛沁雅;盛煥精;曹晨陽(yáng);崔生輝;瞿洪仁
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 代理公司: 西安智萃知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 61221
• 代理人: 李炳輝

本發(fā)明公開(kāi)了一種高純度DNA模板的制備方法，其技術(shù)方案是：將培養(yǎng)的菌株置于加入無(wú)菌去離子水的PCR管中形成混合菌液，將混合菌液置于PCR儀中高溫裂解，后降溫冷卻；然后在離心機(jī)上經(jīng)12000?15000rpm離心，吸取上清液，棄除沉淀物，即獲得高純度DNA模板；依據(jù)需求將獲得的高純度DNA模板直接或經(jīng)稀釋后加入PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明降低了對(duì)后續(xù)擴(kuò)增體系、特別是DNA聚合酶活性的影響，菌體高溫裂解后再將裂解物冷卻，可以使DNA重新快速形成螺旋，獲得的DNA模板純度高、數(shù)量多，DNA模板約占混合菌液量的67%?72%，對(duì)后續(xù)PCR擴(kuò)增過(guò)程中DNA聚合酶的影響較小，極大的提高了擴(kuò)增效率，減少了非特異性擴(kuò)增，制備的DNA模板穩(wěn)定，克服了現(xiàn)有DNA模板制備方法存在的缺陷。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種微生物PCR實(shí)驗(yàn)的DNA模板制作，具體是一種高純度DNA模板的制備方法，屬于微生物領(lǐng)域。

背景技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種廣泛用于生命科學(xué)領(lǐng)域的分子生物學(xué)技術(shù)，用于體外擴(kuò)增特定的DNA片段，而DNA模板的制作是PCR實(shí)驗(yàn)的首要步驟。目前用于制作DNA模板的方法主要包括試劑盒提取法；蛋白酶K消化裂解法；堿變性法；微波法和煮沸法等，但這些方法在使用過(guò)程中都存在一定的缺點(diǎn)。試劑盒提取法需要購(gòu)買(mǎi)商品化試劑盒，提取過(guò)程需要使用冰浴等，操作要求高，程序復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，且不同試劑盒提取的模板質(zhì)量不同；蛋白酶K消化裂解法屬于酶解法的一種，適用于所有樣本的消化處理，但所需的各類(lèi)溶液配制相當(dāng)繁瑣，消化處理后雜質(zhì)較多，需要配合有機(jī)試劑抽提或離心去除雜質(zhì)提高純度，同時(shí)蛋白酶K本身就是一種蛋白雜質(zhì)，經(jīng)過(guò)消化處理的樣品還需高溫滅活蛋白酶K，操作步驟多，耗時(shí)長(zhǎng)，技術(shù)要求較高，有機(jī)試劑的使用對(duì)操作者危害較大；堿變性法是化學(xué)方法的一種，多用于從細(xì)胞中提取DNA，提取時(shí)將樣品置于強(qiáng)堿性環(huán)境中使其裂解，并使所釋放的DNA變性，隨后用酸性溶液中和至中性，質(zhì)粒DNA將迅速?gòu)?fù)性，而基因組DNA由于分子巨大難以復(fù)性，經(jīng)過(guò)離心，質(zhì)粒DNA位于上清液，基因組DNA會(huì)和裂解的菌體一起沉淀至底部，雖特異性強(qiáng)，但還需將所提基因組DNA進(jìn)一步分離，耗時(shí)耗力，且無(wú)法保證強(qiáng)堿環(huán)境是否對(duì)微生物基因序列造成影響；微波法多用于真菌DNA的提取，利用微波處理破碎樣品，使蛋白變性，進(jìn)而使用苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等方法得到基因組DNA，提取步驟繁瑣，成本較高；煮沸法多用于細(xì)菌DNA的提取，通過(guò)高溫使細(xì)胞裂解、DNA解鏈、蛋白質(zhì)變性，溫度下降后DNA重新形成超螺旋分子，通過(guò)離心去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，獲得基因組DNA，雖較為簡(jiǎn)便且適合細(xì)菌模板制備，但操作過(guò)程需要的菌懸液體積及菌量較大，經(jīng)過(guò)高溫處理后釋放的細(xì)胞裂解物及模板中的雜質(zhì)較多，無(wú)法得到質(zhì)量較好的模板，另外在加熱煮沸過(guò)程中經(jīng)常會(huì)因離心管壓力過(guò)大而出現(xiàn)管蓋自行崩開(kāi)的現(xiàn)象，導(dǎo)致管內(nèi)菌液飛濺，容易造成污染。由此可見(jiàn)，現(xiàn)有DNA模板制備方法均存在一定的局限性，是一種較為理想的DNA模板的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為克服現(xiàn)有DNA模板制作中存在的技術(shù)問(wèn)題，而公開(kāi)一種高純度DNA模板的制備方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

a.向滅菌的PCR管中加入無(wú)菌去離子水，標(biāo)號(hào)注明，另備用同樣容積滅菌的PCR管，標(biāo)號(hào)注明；

b.將培養(yǎng)的菌株置于加有無(wú)菌去離子水的PCR管中形成混合菌液，混合菌液的濁度為0.1-0.2MCF（麥?zhǔn)蠞岫龋?/p>

c.將裝有混合菌液的PCR管置于PCR儀中，在99-100℃溫度下裂解10min，后降溫至4℃冷卻；

d.完成裂解后將PCR管置于冰水中水浴或在4℃冰箱內(nèi)穩(wěn)定3-5min， 然后在離心機(jī)上經(jīng)12000-15000rpm離心2-3min，吸取上清液置于備用的PCR管中，棄除沉淀物，即獲得高純度DNA模板，保存于-40℃冰箱內(nèi)；

e．在使用時(shí)，依據(jù)需求將獲得的高純度DNA模板直接或經(jīng)稀釋后加入PCR體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。