[發明專利]利用管蓋內切蟲快速提取單條線蟲DNA的方法

在審

• 申請號: 201910229228.0
• 申請日: 2019-03-25
• 公開（公告）號: CN109750034A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 高波;陳書龍;馬娟;王容燕;李秀花
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6806;C12Q1/686
• 代理公司: 北京修典盛世知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11424
• 代理人: 胡長遠

1.一種利用管蓋內切蟲快速提取單條線蟲DNA的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)、線蟲洗滌：在滅菌的表面皿或潔凈載玻片上滴加滅菌的雙蒸水，用滅菌的挑針將線蟲挑入到所述的雙蒸水中洗滌；

(2)、線蟲的切割：在200μl平蓋EP(Eppendorf)管的管蓋內加入10μl裂解液，然后從步驟(1)已洗滌的線蟲中挑取單條線蟲放于該裂解液中；接著手握EP管體并將管蓋平放于體式顯微鏡下，另一只手用注射器針頭在管蓋內先劃出一道小凹槽，然后將線蟲順放于管蓋內的凹槽內，接著用注射器針頭垂直將線蟲切為兩段，再輕輕將管體倒蓋到管蓋上，掌上離心機瞬時離心，將裂解液與被切割的線蟲一同收集到管底；

(3)、線蟲的裂解及DNA的釋放：將步驟(2)中的包含被切割線蟲的裂解液置于60℃反應5min，98℃反應2min，在掌上離心機上瞬時離心；即得單條線蟲DNA粗提液。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(2)中所述的注射器針頭為≤7號的針頭。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于其步驟(2)中所述的裂解液由裂解緩沖液和蛋白酶k組成；其體積比為：裂解緩沖液：蛋白酶K＝100:1。

4.一種鑒定線蟲的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)、線蟲洗滌：在滅菌的表面皿或潔凈載玻片上滴加滅菌的雙蒸水，用滅菌的挑針將線蟲挑入到所述的雙蒸水中洗滌；

(2)、線蟲的切割：在200μl平蓋EP(Eppendorf)管的管蓋內加入10μl裂解液，然后從步驟(1)已洗滌的線蟲中挑取單條線蟲放于該裂解液中；接著手握EP管體并將管蓋平放于體式顯微鏡下，另一只手用注射器針頭在管蓋內先劃出一道小凹槽，然后將線蟲順放于管蓋內的凹槽內，接著用注射器針頭垂直將線蟲切為兩段，再輕輕將管體倒蓋到管蓋上，掌上離心機瞬時離心，將裂解液與被切割的線蟲一同收集到管底；

(3)、線蟲的裂解及DNA的釋放：將步驟(2)中的包含被切割線蟲的裂解液置于60℃反應5min，98℃反應2min，在掌上離心機上瞬時離心；即得單條線蟲DNA粗提液；

(4)、以步驟(3)所得的線蟲DNA為模板，以通用引物TW81/AB28為引物進行PCR擴增；將所得PCR產物進行分析，從而確定線蟲的種類；其中所述的通用引物序列為：

TW81：5′-GTTTCCGTAGGTGAACCTGC-3′

AB28：5′-ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT-3′。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于其步驟(4)所述PCR擴增的反應體系為：2×Es Taq酶15μl；正反向引物各1μl；線蟲基因組DNA1μl；用ddH₂O補足至30μl；所述PCR擴增的反應條件為：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，30個循環；72℃10min。

6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于其步驟(4)所述的對PCR產物的分析包括凝膠電泳、測序和序列比對分析。