[發明專利]分泌抗柑橘黃龍病菌單抗雜交瘤細胞株及其單抗應用

有效

• 申請號: 201910181831.6
• 申請日: 2019-03-11
• 公開（公告）號: CN109897829B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 吳建祥;周雪平;黃德青;何宛芹;王亞琴;吳佳瑜;謝艷
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/12;G01N33/569;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 傅朝棟;張法高

本發明公開了一種分泌抗柑橘黃龍病菌單抗雜交瘤細胞株及其單抗的應用。柑橘黃龍病葉脈粗提液為抗原免疫BALB/c小鼠，經細胞融合、篩選、克隆，獲得1株能分泌抗柑橘黃龍病菌單抗的雜交瘤細胞株11H9，其保藏號為CGMCC No.17285。該細胞株分泌單抗腹水間接ELISA效價達10^?7，抗體類型及亞類為IgG1、kappa輕鏈，該單抗與病葉中56kDa的黃龍病菌蛋白有特異反應，與健康樹葉不發生免疫反應。利用11H9單抗建立檢測柑橘黃龍病菌的ACP?ELISA、dot?ELISA和Tissue blot?ELISA檢測方法，其中ACP?ELISA和dot?ELISA方法檢測黃龍病葉粗提液的靈敏度分別達到1:20480和1:10240倍稀釋(w/v,g/mL)。抗柑橘黃龍病菌單抗的制備及其檢測方法的建立為柑橘黃龍病的診斷和檢測、流行病學分析、無菌苗木生產及科學防控提供物質和技術支撐。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種分泌抗柑橘黃龍病菌單克隆抗體雜交瘤細胞株及其單抗的應用。

背景技術

20世紀初，柑橘黃龍病已經相繼在亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的50多個國家和地區爆發。我國于1919年在華南地區首次報導了柑橘黃龍病，目前該病陸續在我國廣東、江西、海南、廣西、福建、浙江、云南、貴州、湖南、重慶等省(自治區或直轄市)發生流行，我國柑橘栽培區均遭受柑橘黃龍病危害，受災面積已達總面積的80％，產量損失85％。柑橘產業因為黃龍病的大范圍爆發而面臨著前所未有的危機。柑橘黃龍病是由原核生物薄壁菌門韌皮部桿菌屬細菌(Candidatus Liberibacter sp.)在柑橘等蕓香科果樹上引起的系統性、毀滅性病害。在不同的地區和國家曾有不同的名稱，如黃枯病、青果病、黃梢病等。柑橘黃龍病的病原屬于革蘭氏陰性細菌，寄生于篩管細胞，屬于植物內生細菌，菌體大小約為350-550nm×600-1500nm,可通過篩孔進行移動，病原具兩層外膜,厚約20-25nm。柑橘黃龍病的傳播有3種方式，分別是昆蟲木虱傳播、嫁接傳播和苗木交易，其中嫁接傳播和病苗的交易是柑橘黃龍病遠距離傳播的主要途徑，染病接穗和病苗是主要載體。昆蟲傳播媒介有亞洲柑橘木虱(Diaphorina citri)和非洲柑橘木虱(Trioza erytreae)。

目前，對柑橘黃龍病菌的檢測和診斷多采用低效率的癥狀觀察、指示植物、電鏡觀察、PCR等方法進行檢測，還沒有快速實用、高通量的檢測技術和方法。本發明以柑橘黃龍病葉脈粗提液作為抗原通過雜交瘤技術制備了1株能分泌抗柑橘黃龍病菌特異性單抗的雜交瘤細胞株，并以分泌的單抗為核心建立檢測柑橘黃龍病菌的快速實用、準確、高通量的血清學方法，從而為柑橘黃龍病菌的檢測和診斷、流行病學的調查、無菌苗木的獲得及科學防控體系的建立提供物質和技術支持。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種分泌抗柑橘黃龍病菌單抗的雜交瘤細胞株及其單抗應用。

分泌抗柑橘黃龍病菌單抗的雜交瘤細胞株11H9，它能分泌抗柑橘黃龍病菌的特異性單抗，雜交瘤細胞株11H9于2019年1月25日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.17285。

一種所述的雜交瘤細胞株分泌的抗柑橘黃龍病菌單抗，抗柑橘黃龍病菌單抗腹水間接ELISA效價達10-⁷，抗體類型及亞類為IgG1、kappa輕鏈，該單抗與柑橘黃龍病病葉中56Kda的黃龍病菌蛋白有特異性免疫反應，利用ACP-ELISA和dot-ELISA方法分析發現，單抗檢測黃龍病病葉粗提液的靈敏度分別達到1:20480和1:10240倍稀釋。

抗柑橘黃龍病菌單抗能與來自中國各個地方的感染柑橘黃龍病病葉粗提液有特異性反應，而不與健康的樹葉粗提液反應。

抗柑橘黃龍病菌單抗在該病害檢測上的應用是以單抗為核心建立的各種免疫學檢測方法和免疫學檢測試劑盒。