[發(fā)明專利]一種合成乳酰-N-新四糖的重組枯草芽孢桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910146431.1
• 申請(qǐng)日: 2019-02-27
• 公開（公告）號(hào): CN109735480B
• 公開（公告）日: 2021-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉龍;董曉敏;呂雪芹;李江華;堵國(guó)成;陳堅(jiān)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 光明乳業(yè)股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/90;C12P19/26;C12R1/125
• 代理公司: 北京東正專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11312
• 代理人: 蔡仲德

1.一種合成乳酰-N-新四糖的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述重組枯草芽孢桿菌是通過在宿主菌Bacillus subtilis 168△amyE:P₄₃-lacY，P₄₃-lgtB，P_xylA-comK的基因組上整合兩個(gè)β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因，并外源表達(dá)β-1,3-N-葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶基因得到的。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的合成乳酰-N-新四糖的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述宿主菌是以枯草芽孢桿菌168為出發(fā)菌株，通過以啟動(dòng)子P_xylA調(diào)控基因comK的表達(dá)，乳糖透性酶編碼基因整合到基因組amyE位點(diǎn)，β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶編碼基因整合到基因組ydeS位點(diǎn)和ydzO位點(diǎn)中間得到的。

3.權(quán)利要求1所述的合成乳酰-N-新四糖的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，該構(gòu)建方法包括以下步驟：

(1)通過融合PCR構(gòu)建P43控制表達(dá)的β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因，其中融合片段設(shè)計(jì)的順序依次是，ydaH基因左同源臂片段、博來霉素抗性基因片段、P₄₃啟動(dòng)子片段、β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因片段以及ydzA基因右同源臂片段，這5個(gè)片段按順序組裝獲得重組片段，序列如SEQ ID NO.47所示；

(2)通過融合PCR構(gòu)建P43控制表達(dá)的β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因，其中融合片段設(shè)計(jì)的順序依次是，yszA基因左同源臂片段、氯霉素抗性基因片段、P₄₃啟動(dòng)子片段、β-1,4-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因片段以及ysxE基因右同源臂片段，這5個(gè)片段按順序組裝獲得重組片段，序列如SEQ ID NO.58所示；

(3)將步驟(1)構(gòu)建的重組片段轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis 168△amyE:P₄₃-lacY，P₄₃-lgtB，P_xylA-comK，通過驗(yàn)證獲得重組枯草芽孢桿菌BY03a；

(4)將步驟(2)構(gòu)建的重組片段轉(zhuǎn)化步驟(3)的重組枯草芽孢桿菌BY03a，通過驗(yàn)證獲得重組枯草芽孢桿菌BY03b；

(5)將pP43NMK-lgtA轉(zhuǎn)化重組枯草芽孢桿菌BY03b，得到合成乳酰-N-新四糖的重組枯草芽孢桿菌BY05。

4.權(quán)利要求1所述的重組枯草芽孢桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳酰-N-新四糖中的應(yīng)用。