[發(fā)明專利]一種重組的非洲豬瘟病毒p72亞單位可溶性融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910142648.5
• 申請日: 2019-02-26
• 公開（公告）號: CN111607001B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 錢泓;吳有強;張強;徐玉蘭;吳素芳;車影
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海隆生物科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;G01N33/68;G01N33/569;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 北京乾誠五洲知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11042
• 代理人: 付曉青;李廣文

本發(fā)明公開了一種重組的非洲豬瘟病毒p72亞單位可溶性融合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，所述非洲豬瘟病毒p72亞單位可溶性融合蛋白包括OPTI?p72蛋白和一種伴侶蛋白，其中所述OPTI?p72蛋白的核苷酸序列為經(jīng)優(yōu)化后的序列OPTI?p72如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明能夠在大腸桿菌中直接可溶性表達(dá)P72，克服了現(xiàn)有技術(shù)中的諸多問題，且制備方法簡單、成本低。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。涉及一種重組的非洲豬瘟P72亞單位可溶性融合蛋白及在制備診斷、預(yù)防和治療非洲豬瘟疫苗中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

非洲豬瘟(African?swine?fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African?swine?fevervirus，ASFV)引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病。豬是ASFV自然感染的唯一哺乳動物宿主，包括家豬和野豬，尤其是家豬，易感性極高。豬感染非洲豬瘟病毒后臨床上以皮膚充血，內(nèi)臟器官出血，高熱為特征，發(fā)病率及死亡率高達(dá)100％。世界動物衛(wèi)生組織將其列為A類疫病，我國也將其列為一類動物傳染病。

2018年8月份以來，非洲豬瘟在我國多個省份爆發(fā)，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。盡管已經(jīng)有許多非洲豬瘟的研究性報告，但目前世界上尚未有有效預(yù)防非洲豬瘟的疫苗和治療該病的藥物發(fā)現(xiàn)，迫切需要新型疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)來預(yù)防非洲豬瘟。

ASFV病毒是具有囊膜的蟲媒DNA病毒。病毒顆粒呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，平均直徑200nm，表面有含糖脂類的囊膜覆蓋。其病毒基因組為雙股線性DNA，大小為170-190kb，整個基因組大約有150個ORF，編碼150-200個蛋白質(zhì)。P72蛋白由ASFV病毒B646L基因編碼的，分子量大小約32kD的蛋白。是非洲豬瘟病毒粒子形成二十面體衣殼的的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占整個病毒粒子的32％。研究發(fā)現(xiàn)，p72蛋白相對比較保守，有穩(wěn)定的抗原性。且與病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞的過程有關(guān)，針對p72的抗體能夠抑制病毒與巨噬細(xì)胞的結(jié)合。因此，p72是一個很好的保護(hù)性抗原。目前，已經(jīng)有P72蛋白能成功的表達(dá)在原核系統(tǒng)，但表達(dá)產(chǎn)量低，且以包涵體形式存在(具體參見公開號為CN103805615的發(fā)明專利)，無法滿足基因工程亞單位疫苗的開發(fā)。而利用本發(fā)明提供的方法可大量可溶性表達(dá)P72蛋白。在當(dāng)前沒有可能大規(guī)模制備滅活疫苗或弱毒疫苗的情況下，確定一種制備該病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一種能夠預(yù)防該疾病的亞單位疫苗或具有能夠診斷該疾病的試劑具有重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容

在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上，本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的諸多缺陷(如表達(dá)產(chǎn)量低，包涵體表達(dá)，純化困難成本相對較高等)，提供了一種制作成本低廉可在大腸桿菌中直接可溶性表達(dá)p72亞單位可溶性融合蛋白及其制備方法。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種可在大腸桿菌中表達(dá)p72蛋白的優(yōu)化后的OPTI-p72的核苷酸序列。為了能夠在大腸桿菌中高效表達(dá)P72蛋白，本發(fā)明根據(jù)GenBank:FR682468.1上已經(jīng)存在公開的序列(密碼子優(yōu)化前的編碼P72蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示)，我們對p72基因進(jìn)行分析，首先對p72基因編碼的密碼子的在原核表達(dá)中的密碼子偏好性進(jìn)行了優(yōu)化，其次對p72基因的GC含量和mRNA在大腸桿菌的穩(wěn)定性進(jìn)行優(yōu)化。所述最終優(yōu)化后OPTI-p72的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。因此，所述非洲豬瘟病毒p72亞單位可溶性融合蛋白包括OPTI-p72蛋白和一種伴侶蛋白，其中所述OPTI-p72蛋白的核苷酸序列為p72蛋白經(jīng)優(yōu)化后的序列OPTI-p72如SEQ?ID?NO.1所示。

在本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述伴侶蛋白為TF蛋白。

在本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，優(yōu)化后的OPTI-p72直接在原核表達(dá)系統(tǒng)中也不能可溶性表達(dá)p72，為了能夠得到可溶性表達(dá)P72蛋白，本發(fā)明在OPTI-p72核苷酸序列3’端或5’端加入伴侶蛋白的基因編碼序列，其中伴侶蛋白優(yōu)選為TF，得到OPTI-TF-P72。優(yōu)選地，5’端加入TF基因編碼OPTI-TF-p72的基因編碼序列如SEQ?ID?NO.3所示，其氨基酸序列如SEQ?IDNO.4所示。