[發明專利]用于高效擴增NK的人工抗原遞呈細胞及其構建方法

有效

• 申請號: 201910138714.1
• 申請日: 2019-02-25
• 公開（公告）號: CN109810197B
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 李晨蔚;周春燕
• 申請（專利權）人: 上海尚泰生物技術有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N5/10;C12N5/0783
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 華珊;徐迅

本發明提供了用于高效擴增NK的人工抗原遞呈細胞及其構建方法。具體地，本發明涉及一種融合蛋白，所述融合蛋白包括IL?15、IL?21和MICA蛋白，以及任選的標簽序列和/或信號肽序列。實驗結果表明表達本發明融合蛋白的細胞能夠很好地誘導NK細胞增殖、分化和活化，制備得到的NK細胞數量多、純度高、殺傷活性強。本發明將基因串聯表達，實現了其1：1的100％表達，同時簡化了操作流程且大大降低了時間及人力成本。本發明優化了用于NK細胞人工抗原遞呈細胞的構建方法，為以后的NK細胞在腫瘤治療及預防等中的應用奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域。具體地，本發明涉及用于高效擴增NK的人工抗原遞呈細胞及其構建方法。

背景技術

自然殺傷(Nature Killer，NK)細胞，是一種自然殺傷細胞，具有以下特征：1、無需特異性抗原識別；2、直接殺傷靶細胞；3、不受MHC限制；4、具有較廣的抗瘤譜；5、基本無不良反應。在控制癌癥的發生和發展中起著非常重要的作用。其可以通過釋放穿孔素/顆粒酶、ADCC效應、Fas/FasL系統及NK細胞毒因子消滅人體內的病毒、細菌以及癌細胞。是人體先天免疫的核心組成部分，它是除T淋巴細胞、B淋巴細胞之外的第三類淋巴細胞。它作為人體第一道防線，能夠清除病毒、細菌等有害物質，同時還可以清除衰老、病變及癌變的細胞，從而維持人體的健康。由于以上NK其獨特的特點，其在腫瘤免疫治療中的應用越來越受到重視。在日本，NK細胞不僅廣泛用于癌癥病人治療，還應用于亞健康人群，預防癌癥發生。因此，如何獲得大量的NK細胞成為目前亟待解決的問題。

目前，NK細胞體外擴增培養的方法主要有以下三種：(1)使用IL-2和IL-15等白介素類細胞因子刺激培養的方法，往往需要進行分選，培養成本高，往往出現數量或純度難以滿足實驗要求的情況，無法應用于大規模臨床研究；(2)利用CD16等抗體進行NK活化后進行擴增培養，在不同批次細胞擴增效率和NK細胞活性上存在較大差異。因此，目前主要還是應用人工抗原遞呈細胞。人工抗原遞呈細胞(aAPC)是新興起的一種免疫治療新策略，是在一定的載體表面表達MHC及共刺激分子、粘附分子的配體或抗體等，模擬天然抗原遞呈細胞。而目前，現有的人工抗原遞呈細胞并不能很好地擴增或活化NK細胞。

因此本領域急需開發一種用于培養NK細胞的人工抗原遞呈細胞及其制備方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于培養NK細胞的人工抗原遞呈細胞及其制備方法。

本發明的第一方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包括IL-15、IL-21和MICA蛋白，以及任選的標簽序列和/或信號肽序列。

在另一優選例中，所述融合蛋白依次包括IL-15、IL-21和MICA蛋白。

在另一優選例中，所述融合蛋白中，IL-15、IL-21和MICA蛋白串聯連接。

在另一優選例中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白之間可以為無或通過連接肽連接。

在另一優選例中，所述連接肽選自下組：柔性肽、剛性肽、2A肽、IRES、或其組合。較佳地，所述連接肽為柔性肽。

在另一優選例中，所述融合蛋白中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩爾比為(0.8-1.2)：(0.8-1.2)：(0.8-1.2)。

在另一優選例中，所述融合蛋白中，所述IL-15、IL-21和MICA蛋白的摩爾比為1：1：1。

在另一優選例中，所述融合蛋白具有式I所述結構：

L-I1-X1-I2-X2-I3-X3 (I)，

其中，

L為無、或標簽序列或信號肽序列；

I1為無或第一連接肽；