[發明專利]重組人蛋白激酶Nek2蛋白表達和純化方法

在審

• 申請號: 201910134212.1
• 申請日: 2019-02-22
• 公開（公告）號: CN109706160A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 何敏;楊麗超;陳秋利;溫莎;李輝
• 申請（專利權）人: 廣西醫科大學
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N9/12;C12N15/70;C07K16/40
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司 45104
• 代理人: 黃永校

本發明涉及基因工程技術領域，具體是重組人蛋白激酶Nek2蛋白表達和純化方法。利用PCR技術從人HL7702細胞中克隆Nek2全長cDNA，然后利用原核表達系統將該基因在大腸桿菌BL21(DE3)中進行表達，再進行過Ni瓊脂糖凝膠層析柱及KCl切膠回收兩步純化，獲得重組人蛋白激酶Nek2的純化蛋白。根據本發明所述方法制備的重組人蛋白激酶Nek2蛋白具有高純度、高產率、低成本、簡便操作的特征，有助于進一步自主研發和制備該蛋白的單克隆抗體。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體是重組人蛋白激酶Nek2蛋白表達和純化方法。

背景技術

NIMA(never in mitosis A)相關蛋白激酶2(NIMA-related expressed kinase-2，Nek2)與細胞有絲分裂密切相關，主要作用是調節中心體分離。Nek2異常表達可導致中心體異常，會影響細胞有絲分裂的正常進行，導致細胞周期調控異常，造成細胞異常增殖，進而導致腫瘤的發生、發展。Nek2在人類多種腫瘤，包括非小細胞型肺癌、骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸直腸癌、惡性外周神經鞘瘤、腎細胞癌、胰腺導管腺癌等中的表達量異常升高，提示Nek2可能是一個重要的腫瘤標志物，其表達量可以預示腫瘤增殖和預后情況。

發明內容

本發明的目的是提供一種原核表達的高純度、高產率、低成本、操作簡便的重組人蛋白激酶Nek2蛋白表達和純化方法，有助于進一步自主研發和制備該蛋白的單克隆抗體。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：提供一種重組人蛋白激酶Nek2蛋白的基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

重組人蛋白激酶Nek2蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

所述的重組人蛋白激酶Nek2蛋白的表達方法，包括：

將人Nek2基因構建到原核表達載體pET30a(+)上，構建重組表達載體pET30a(+)-Nek2，并將所述的重組表達載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中，獲得重組工程菌株，將所述的重組工程菌株進行培養并加入誘導劑IPTG進行誘導表達重組人蛋白激酶Nek2蛋白，

所述的表達載體pET30a(+)上含有T7啟動子和由6個組氨基酸組成的標簽序列。

所述的重組人蛋白激酶Nek2蛋白的目的基因序列為Nek2全長序列，利用PCR技術從人HL7702細胞中克隆Nek2全長cDNA，以此cDNA為模板進行PCR擴增，其上游引物F(B)如序列表SEQ ID NO.3所示：AAAGGATCCATGCCTTCCCGGGCTGAGGACTAT(劃線部分為Bam HⅠ酶切位點)，下游引物R(Sa1Ⅰ)如序列表SEQ ID NO.4所示：AAAGTCGACCTAGCGCATGCCCAGGATCTGT(劃線部分為Sa1Ⅰ酶切位點)。

所述的構建原核表達載體的方法為：利用PCR技術從人HL7702細胞中克隆Nek2全長cDNA，以此cDNA為模板進行PCR擴增得到的PCR擴增產物與表達載體pET30a(+)分別用BamHⅠ和Sa1Ⅰ酶進行雙酶切，酶切產物經DNA純化試劑盒純化，然后將純化產物用T4Ligase連接，構建重組表達載體pET30a(+)-Nek2。

所述的重組基因工程菌株為BL21-pET30a(+)-Nek2。

誘導Nek2蛋白表達的條件為：37℃，200rpm條件下培養約2.5-3h至對數生長期，加入終濃度為0.2mM的IPTG誘導8h，誘導表達的重組人蛋白激酶Nek2蛋白為包涵體蛋白。