[發明專利]一種杏鮑菇組成型啟動子及其應用

有效

• 申請號: 201910108223.2
• 申請日: 2019-02-03
• 公開（公告）號: CN109762819B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 尚俊軍;鮑大鵬;楊瑞恒;唐利華;李焱;李燕;茅文俊;汪瀅;龔明
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/11;C12N15/80
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所(普通合伙) 31233
• 代理人: 黃志達;魏峯

本發明涉及一種杏鮑菇組成型啟動子及其應用，所述啟動子序列的核苷酸序列如SEQ NO.1所示。本發明可以高效地驅動外源基因在杏鮑菇中表達，為通過遺傳方法改良符合生產需求和消費者喜愛的杏鮑菇新品種奠定基礎，具有良好的市場應用前景。

技術領域

本發明屬于啟動子領域，特別涉及一種杏鮑菇組成型啟動子及其應用。

背景技術

杏鮑菇是一種重要的食用和藥用蘑菇，近年來我國杏鮑菇的工廠化栽培發展非常迅速。利用杏鮑菇中基因組中的組成型基因的啟動子來驅動外源功能基因表達，是快速改良杏鮑菇品種的重要方法。

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GPD)是糖酵解途徑中的關鍵酶之一，催化NADH依賴性的二羥丙酮磷酸轉化為甘油-3磷酸。由于功能保守，GPD基因在人類、動物、植物和真菌中廣泛存在。不同物種的GPD基因家族可能包含一到幾個成員。序列比較顯示不同物種的GPD蛋白高度保守并且含有NAD+結合結構域，C末端催化結構域和一些保守氨基酸殘基。

GPD在很多不同的物種中都是高表達的基因。例如，GPD mRNA占釀酒酵母中總poly(A)+RNA的2-5％。由于GPD的高表達，GPD基因的啟動子經常被用于遺傳轉化載體中驅動擔子菌中的異源基因表達。但是，在含有多個GPD拷貝的物種中，從正確的GPD拷貝中選擇啟動子至關重要，否則啟動子可能在某些發育階段或環境條件中不起作用，甚至可能完全不起作用。因此，需要分析杏鮑菇的GPD基因家族不同成員的表達情況，并開發出一種新的高效啟動子。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種杏鮑菇組成型啟動子及其應用，該啟動子可以高效地驅動外源基因在杏鮑菇中表達。

本發明提供了一種杏鮑菇組成型啟動子，所述啟動子序列的核苷酸序列如SEQNO.1所示。

本發明還提供了一種用于體外擴增所述的啟動子的引物，其序列如SEQ NO.2-3所示。

本發明還提供了一種啟動子在杏鮑菇中過量表達外源基因中的應用。

通過BLAST分析，從杏鮑菇基因組中找到了兩個GPD基因，它們的蛋白序列一致性高達95.8％，將其分別命名為PeGPD1和PeGPD2。將它們的蛋白序列與其他已發表的擔子菌GPD蛋白序列進行比較發現，杏鮑菇GPD與平菇GPD的相似性最高，達到99％，與鳳尾菇、真姬菇、香菇和雙孢菇的GPD相似性分別為92.5、81.1、79.5和66.8。基于GPD氨基酸序列構建的進化樹顯示，GPD之間的關系較好地反映了編碼這些蛋白質的物種之間的進化關系(圖1)。

為了揭示PeGPD1和PeGPD2的表達模式，從杏鮑菇轉錄組測序數據中研究了這兩個基因的表達情況。盡管PeGPD1在氨基酸水平上與PeGPD2非常相似，但在編碼序列的1011個核苷酸中它們之間存在145個SNP(單核苷酸多態性)。使用這些SNP，可以區分轉錄組數據中的PeGPD1和PeGPD2的讀數。分析表明，PeGPD1在杏鮑菇的不同發育階段都為組成型高表達，包括菌絲體期、原基發生期和兩個子實體期。PeGPD2的表達水平在所有發育階段都遠低于PeGPD1(圖2)。

本發明還進一步研究了PeGPD1起始密碼子上游的一千個核苷酸的啟動子區域的保守元件。分析結果顯示轉錄起始點位于起始密碼子ATG上游61個核苷酸處。三個CAAT盒位于轉錄起始點上游-380nt，-342nt和-248nt處。TATA盒位于轉錄起始點-29nt處(圖3)。結合轉錄分析和序列分析的結果，發現PeGPD1在所有發育階段都是組成型和高表達的。因此，PeGPD1的啟動子可用于驅動外源基因在杏鮑菇中表達。

有益效果

本發明可以高效地驅動外源基因在杏鮑菇中表達，為通過遺傳方法改良符合生產需求和消費者喜愛的杏鮑菇新品種奠定基礎，具有良好的市場應用前景。