[發明專利]用于鑒定小麥春化基因VRN-D4的試劑盒及其專用成套引物對

有效

• 申請號: 201910098019.7
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109666757B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 陳東升;張曉科;李瑞博;亢玲;張維軍;哈東;李哲;何進尚;王小亮;張富國
• 申請（專利權）人: 寧夏農林科學院農作物研究所（寧夏回族自治區農作物育種中心）
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

本發明公開了用于鑒定小麥春化基因VRN?D4的試劑盒及其專用成套引物對。本發明用于鑒定VRN?D4基因的成套引物對由引物對甲和引物對乙組成；所述引物對甲由序列1所示的單鏈DNA分子和序列2所示的單鏈DNA分子組成；所述引物對乙由序列3所示的單鏈DNA分子和序列4所示的單鏈DNA分子組成。本發明針對VRN?D4基因編碼區第367位堿基變異重新設計1個CAPS標記，使擴增的目的片段內只含有一個限制性內切酶的酶切位點，以便達到縮短酶切時長和降低試劑成本的目的。本發明開發了該基因更加簡便、快速、可靠、實用的分子標記，對小麥育種、引種和推廣具有重要意義。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及用于鑒定小麥春化基因VRN-D4的試劑盒及其專用成套引物對。

背景技術

近百年來，全球氣候正在經歷著一次以變暖為主要特征的顯著變化，氣候變化已成為當今科學界、各國政府和社會公眾強烈關注的重大環境問題之一。小麥是我國乃至世界上重要的糧食作物之一，氣候變化給小麥的育種和生產工作提出了新的挑戰和機遇。培育和推廣能夠適應外界環境變化、最大限度利用光熱資源的品種，是奪取小麥高產和穩產的最經濟最有效途徑。通過調整小麥生長發育階段使其更好的適應外界生長環境條件，只有這樣才能夠最大限度地降低作物減產風險從而確保小麥豐產。研究認為，不同地理氣候條件下小麥生長發育適應性主要受春化基因(VRN)、光周期基因(PPD)及早熟基因(EPS)控制，其中春化基因對小麥生長發育適應性影響最大，貢獻率約占70-75％。

在冬小麥的生長發育進程中，必須要經歷一段時期的低溫處理，才能夠抽穗開花，這個過程叫春化作用。小麥的春化作用是由四種春化基因VRN1、VRN2、VRN3和VRN4控制。與野生型等位變異相比，春化基因特定區域序列變異的等位變異使小麥品種的冬春習性發生改變，不同春化基因型決定小麥冬春習性強弱程度差異，使得完成春化過程所需低溫時間也就不同，造成生長發育的進程不同，具備不同的生長習性，表現出小麥品種不同的抗凍害特性。已有研究表明，不同國家或地區的小麥具有不同春化基因組成類型，不同的春化基因組成類型與不同地區自然環境有關，是小麥適應環境能力的遺傳基礎，即不同國家或地區推廣的小麥品種具備特定春化基因的組成類型。早在2000年Iwaki等就報道，中國小麥存在VRN-D4基因；隨后Zhang等(2008)研究也證實我國小麥存在VRN-D4基因。Kippes等(2015)認為VRN-D4是小麥重要的春化基因之一，其可以增加小麥遺傳的多樣性，增強小麥適應不同生態地區和氣候變化能力。

與前三個春化基因VRN1、VRN2和VRN3相比，VRN4的研究相對滯后，近年來在小麥5D染色體上才克隆了VRN4基因，被命名為VRN-D4基因。該基因與SSR的分子標記Xcfd78和Xbarc205緊密連鎖，與Xcfd67和BG313707標記存在共分離現象，此共分離標記常被用來作為VRN-D4基因的鑒定標記使用，但在實際檢測過程當中發現有些材料卻無法使用共分離標記得到有效的鑒別。進一步研究發現，VRN-D4其實是VRN-A1基因的1個拷貝基因，起源于小麥的5AL大片段插入5DS、所插入的片段中恰好包含了1個VRN-A1基因，只是在第一內含子區域和編碼區第四外顯子區域存在有兩個功能結構域的變異。因此，前人對VRN-D4基因進行鑒定的時候，需要同時檢測5DS區域是否存在5AL大片段的插入和編碼區是否存在特定堿基的變異。與VRN-A1基因序列相比，VRN-D4基因在第1內含子區域存在有3個鄰近的特異性SNP(G2780C、T2783C、C2784T)，而此位點區域正好屬于一個開花抑制因子TaGRP2識別的保守區域RIP-3，由于該區域SNP多態性的改變使得開花抑制因子TaGRP2無法與該基因結合，導致攜帶春化基因VRN-D4小麥能夠提早抽穗開花。同時，與VRN-A1序列相比，VRN-D4基因在第四外顯子上第367位堿基存在有1個單堿基突變(A367C)，該處堿基的變化會導致氨基酸序列的變化(由原來的賴氨酸變成谷氨酰胺)，而此位點屬于MADS轉錄因子的K-Box結構域，與植物生長發育進程密切相關。