[發明專利]一種間充質干細胞的超低溫凍存與復蘇方法

在審

• 申請號: 201910096800.0
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109699634A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 趙進軍;谷廣其;楊桂花;趙宇飛;李張鵬
• 申請（專利權）人: 和攜科技（北京）有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0775
• 代理公司: 北京慧尚知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11743
• 代理人: 吉海蓮;肖輔珍

本發明提供了一種無血清間充質干細胞凍存液，以及使用該凍存液對間充質干細胞進行超低溫凍存與復蘇的方法。相比現有技術中含有胎牛血清的凍存液及使用其的凍存復蘇方法，使用本發明的無血清凍存液對間充質干細胞進行凍存，凍存過程沒有加入胎牛血清，這避免了引入異種來源蛋白可能帶來的風險；采用封口操作、程序降溫盒，以及通過氣相液氮罐存儲細胞，在確保凍存效果的同時有效降低凍存過程中液氮的進入，從而降低凍存過程中污染和復蘇時炸管的風險，最終間充質干細胞復蘇后的活率達到90％以上，能夠滿足間充質干細胞臨床應用的需要。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，具體涉及一種間充質干細胞的超低溫凍存與復蘇方法。

背景技術

間充質干細胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是一類來源于發育早期中胚層及外胚層的多能干細胞，具有自我更新和多向分化的能力。間充質干細胞在臨床上可應用于解決多種血液系統疾病、心血管疾病、肝硬化、神經系統疾病、膝關節半月板部分切除損傷修復、自身免疫性疾病等，此外還在神經系統修復等方面具有發展前景。

間充質干細胞最早在骨髓中發現，隨后發現存在于人體發生、發育過程的許多種組織中。目前用得最多的是骨髓來源的間充質干細胞，但存在以下問題：隨著年齡的老化，骨髓間充質干細胞數目顯著降低、增殖分化能力大幅度衰退；其制備過程不容易質控；移植給異體時可能引起免疫反應；取材時對患者有損傷，患者有骨髓疾病時不能采集，即使是健康供者，亦不能抽取太多的骨髓。

研究表明，臍帶來源的間充質干細胞表達多種胚胎干細胞的特有分子標志物，并具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低的特性；另外其取材方便，無道德倫理問題的限制，更易于工業化制備。因此，臍帶間充質干細胞不僅能夠成為骨髓間充質干細胞的理想替代物，而且具有更大的應用潛能。

通常干細胞凍存時的凍存液需要使用胎牛血清(FBS)，否則細胞復蘇活率較低；雖然FBS可為間充質干細胞提供必要的營養物質，但FBS屬于動物源性物質，成分比較復雜，在臨床應用上存在潛在的風險，也增加了細胞污染的幾率。另外，凍存細胞的存儲采用普通液氮罐居多，由于凍存管長期浸于液氮中，難免會有液氮進入到凍存管中，這樣一方面增加了凍存細胞被污染的風險，另一方面在復蘇細胞時也存在因操作不慎而炸管的風險。

綜上所述，如何有效地提高凍存細胞的復蘇率和培養擴增后的細胞活率，是目前本領域技術人員急需解決的問題。

發明內容

為了克服以上細胞凍存和復蘇的現有技術中存在的缺點，本發明一個目的在于提供一種間充質干細胞凍存液，其由以下體積比的各組分組成：3-10％GMP級血清替代物，8-10％DMSO，5-25％人血白蛋白，以及55-84％α-MEM基礎培養基。

在本發明上述凍存液的一些實施方案中，所述間充質干細胞凍存液由以下體積比的各組分組成：10％GMP級血清替代物如Helios或PALL牌的產品，10％DMSO，10％人血白蛋白，以及70％α-MEM基礎培養基如Corning、Hyclone或BI牌的產品。

在本發明上述凍存液的一些實施方案中，所述間充質干細胞為從人源臍帶組織獲取的間充質干細胞。

本發明另一個目的在于還提供一種使用上述凍存液對間充質干細胞進行超低溫凍存與復蘇的方法，其包括以下步驟：

1)從原代間充質干細胞擴增的干細胞經消化后，用由基礎培養基和血清替代物組成的完全培養基重懸，其中所述完全培養基中含有3-5％體積比的血清替代物，然后分別用權利要求1-3的凍存液調整細胞懸液中的細胞密度，然后將細胞懸液分裝于凍存管中，貼好標簽，用醫用膠帶封口；

2)迅速將上述凍存管放于程序降溫盒中；

3)再將所述程序降溫盒迅速放入-80℃冰箱中過夜；

4)將所述間充質干細胞迅速由冰箱轉移至液氮罐中進行凍存；