[發(fā)明專利]一種間充質(zhì)干細胞的超低溫凍存與復(fù)蘇方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910096800.0
• 申請日: 2019-01-31
• 公開（公告）號: CN109699634A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙進軍;谷廣其;楊桂花;趙宇飛;李張鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 和攜科技（北京）有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/0775
• 代理公司: 北京慧尚知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11743
• 代理人: 吉海蓮;肖輔珍

1.一種間充質(zhì)干細胞凍存液，其特征在于，由以下體積比的各組分組成：3-10％血清替代物，8-10％DMSO，5-25％人血白蛋白，以及55-84％α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.如權(quán)利要求1所述的間充質(zhì)干細胞凍存液，其特征在于，由以下體積比的各組分組成：10％GMP級血清替代物如Helios或PALL牌產(chǎn)品，10％DMSO，10％人血白蛋白，以及70％α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基如Corning、Hyclone或BI牌產(chǎn)品。

3.如權(quán)利要求1或2所述的間充質(zhì)干細胞凍存液，其特征在于，其中所述間充質(zhì)干細胞為從人源臍帶組織獲取的間充質(zhì)干細胞。

4.使用權(quán)利要求1-3的凍存液對間充質(zhì)干細胞進行超低溫凍存與復(fù)蘇的方法，其包括以下步驟：

1)從原代間充質(zhì)干細胞擴增的干細胞經(jīng)消化后，用由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和血清替代物組成的完全培養(yǎng)基重懸，其中所述完全培養(yǎng)基中含有3-5％體積比的血清替代物，然后分別用權(quán)利要求1-3的凍存液調(diào)整細胞懸液中的細胞密度，然后將細胞懸液分裝于凍存管中，貼好標(biāo)簽用封口膜或醫(yī)用膠帶封口；

2)迅速將上述凍存管放于程序降溫盒中；

3)再將所述程序降溫盒迅速放入-80℃冰箱中過夜；

4)將所述間充質(zhì)干細胞迅速由冰箱轉(zhuǎn)移至液氮罐中進行凍存；

5)將上述液氮罐中凍存了一定時間的間充質(zhì)干細胞凍存管取出，快速放入37-40℃水浴鍋中，迅速搖晃凍存管，使其受熱均勻，注意水面不得沒過凍存管瓶蓋；

6)當(dāng)凍存管中的間充質(zhì)干細胞融化后，迅速將所述凍存管中的干細胞轉(zhuǎn)移至生理鹽水中，1000-1500rpm離心3-5min，棄上清，使用生理鹽水洗滌，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，取樣測定細胞的總數(shù)和復(fù)蘇活率；

7)調(diào)整上述細胞懸液中的間充質(zhì)干細胞如P2代的密度，然后接種于細胞培養(yǎng)瓶中；

8)將所述培養(yǎng)瓶置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察新一代間充質(zhì)干細胞生長情況，如由P2代復(fù)蘇培養(yǎng)后的干細胞即P3代，取樣測定間充質(zhì)干細胞的總數(shù)，計算細胞活率。

5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟1)中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基如Corning、Hyclone或BI牌產(chǎn)品，且所述血清替代物為GMP級血清替代物如Helios或PALL牌產(chǎn)品，并調(diào)整細胞懸液的細胞密度為6×10⁶/mL-7×10⁶/mL，然后按1mL/管將細胞懸液分裝于凍存管中。

6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述程序降溫盒為美國BIOCISION公司的程序降溫盒。

7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟4)中所述液氮罐為氣相液氮罐。

8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟6)中當(dāng)凍存管中的間充質(zhì)干細胞融化后，迅速將所述凍存管中的干細胞轉(zhuǎn)移至50mL生理鹽水中，1200rpm離心3min，棄上清，使用生理鹽水洗2次。

9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟7)中以5000-6000個/cm²的起始接種密度將所述細胞懸液中的間充質(zhì)干細胞接種于T-175細胞培養(yǎng)瓶中，總體積為25mL/瓶。

10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟8)中將所述培養(yǎng)瓶置于細胞培養(yǎng)箱中，于37℃、5％CO₂下繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。