[發明專利]一種高效合成鳥苷二磷酸巖藻糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201910093694.0
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN109749976B
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 劉龍;鄧潔瑩;陳春梅;呂雪芹;李江華;堵國成;陳堅
• 申請（專利權）人: 光明乳業股份有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/54;C12N15/75;C12P19/18;C12P19/02;C12R1/125
• 代理公司: 北京東正專利代理事務所(普通合伙) 11312
• 代理人: 蔡仲德

本發明提供了一種高效合成鳥苷二磷酸巖藻糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用，所述重組芽孢桿菌是通過在枯草芽孢桿菌168的基因組中強化表達鳥苷酸激酶和核苷二磷酸激酶基因，并表達外源巖藻糖激酶和磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因得到的。本發明通過改造枯草芽孢桿菌168獲得了可高效合成鳥苷二磷酸巖藻糖的菌株，其胞內積累量高達196.15g/L。本發明通過強化表達鳥苷酸激酶和核苷二磷酸激酶基因，強化胞內GDP?L?fucose合成輔因子GTP的供應，促進了鳥苷二磷酸巖藻糖的合成。本發明重組枯草芽孢桿菌的構建方法簡單，便于使用，具有很好的應用前景。

技術領域

本發明屬于遺傳工程的技術領域，具體涉及一種高效合成鳥苷二磷酸巖藻糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用。

背景技術

母乳中含有重要營養成分，生物活性物質，刺激腸道菌群生長的因子。其中，母乳寡糖(Human Milk Oligosacchrides,hMOs)在許多生理功能上起到了關鍵的作用，例如促進雙歧桿菌生長，病原體感染的抑制作用，和提高免疫反應。母乳寡糖中的藻糖基化的寡糖(FOSs)由于其生理功能如其作為腸道致病菌的受體類似物的能力、促進免疫調節的能力和減少炎癥的能力，已經獲得了極大的關注。因為藻糖基化的寡糖是由巖藻糖基轉移酶催化進行糖類巖藻糖基化而成，這就需要鳥苷二磷酸巖藻糖 (GDP-L-fucose)作為巖藻糖基的供體。隨著巖藻糖基化的寡糖的熱度越來越高，許多制藥公司試圖通過化學方法和生物方法高效合成充足的 GDP-L-fucose。在化學高效合成中，GDP-L-fucose以L-巖藻吡喃糖基四乙酸為起始原料，由HBr、Ag₂CO₃、N-四丁銨磷酸二甲苯酯等物質引發的化學反應。GDP-L-fucose是可拉酸的前體，可拉酸是革蘭氏陰性菌細胞壁的主要成分，因此，一些腸道細菌如大腸桿菌和沙門氏菌能在體內高效合成GDP-L-巖藻糖。在生物中發現了兩種高效合成GDP-L-fucose的代謝途徑：補救途徑和從頭途徑。

補救途徑是在人類的代謝途徑中發現的，外源的巖藻糖轉移到胞內，由巖藻糖激酶消耗ATP磷酸化(EC 2.7.1.52)形成巖藻糖-1-磷酸 (Fuc-1-P)。Fuc-1-P結合鳥苷三磷酸(GTP)在巖藻糖-1-磷酸鳥苷酰基轉移酶(L-fucose-1-phosphate guanylyltransferase)(EC 2.7.7.30)的催化下生成GDP-L-巖藻糖。從頭高效合成途徑普遍存在于原核生物和真核生物中，其中GDP-L-fucose是由GDP-甘露糖通過甘露糖脫氫酶(GMD， EC4.2.1.47)和GDP-巖藻糖高效合成酶(WCAG，EC 1.1.1.271)催化高效合成的。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是一種被廣泛用作食品酶制劑及重要營養化學品的生產宿主，其產品被FDA認證為“generally regarded as safe” (GRAS)安全級別。

因此，如何利用枯草芽孢桿菌，通過生物方法高效高效合成鳥苷二磷酸巖藻糖，仍是本領域亟待解決的問題。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種高效合成鳥苷二磷酸巖藻糖的重組枯草芽孢桿菌及其構建方法與應用，構建的重組枯草芽孢桿菌可以高效高效合成鳥苷二磷酸巖藻糖。

具體的，一方面，本發明提供了所述重組芽孢桿菌是通過在枯草芽孢桿菌168的基因組中強化表達鳥苷酸激酶和核苷二磷酸激酶基因，并表達外源巖藻糖激酶和磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因得到的。