[發明專利]一種檢測豬可食性組織中氟苯尼考總殘留物的方法及應用

有效

• 申請號: 201910091751.1
• 申請日: 2019-01-30
• 公開（公告）號: CN109709258B
• 公開（公告）日: 2021-07-20
• 發明（設計）人: 楊波;李亞超;周丹娜;王前勇;高進東
• 申請（專利權）人: 武漢生物工程學院
• 主分類號: G01N30/90
• 分類號: G01N30/90;G01N30/94;G01N30/95;G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/34;G01N30/74;G01N30/86;G01N30/88
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 彭勁松

1.一種檢測豬可食性組織中氟苯尼考總殘留物的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）取豬可食性組織，于組織勻漿機中制成勻漿，組織勻漿的轉數為3000-10000 r/min，時間為2-5 min；

（2）在組織勻漿中加入高濃度鹽酸溶液，渦旋后置于水浴中至組織完全水解，渦旋的時間為1-3 min；其中，鹽酸溶液的終摩爾濃度為4-8 N，組織勻漿和鹽酸溶液的質量體積比為（1-2）g:（2-8）mL，水浴溫度為80-100 ℃，水浴時間為2-24 h；氟苯尼考及代謝物在此條件下完全水解成氟苯尼考胺；

（3）待冷卻后，在水解后的樣品中加入乙酸乙酯，渦旋1-3 min，3000-8000 g離心5-10min，棄去乙酸乙酯；其中，水解后的樣品與乙酸乙酯的體積比為（3-6）:（4-40）；

（4）在剩余樣品中加入高濃度氫氧化鈉溶液調節pH至10-12；其中，氫氧化鈉溶液的質量百分比濃度為20%-50%，加入體積為0.5-5 mL；

（5）在堿化后的樣品中加入乙酸乙酯，渦旋1-3 min，3000-8000 g離心5-10 min，轉移乙酸乙酯至另一干凈離心管內；其中，堿化后的樣品與乙酸乙酯的體積比為（3-8）:（4-10）；

（6）用等量乙酸乙酯重復上述操作一次，合并乙酸乙酯；

（7）分批次轉移乙酸乙酯至含適量冰乙酸溶液的離心管內，空氣流揮干乙酸乙酯，空氣流揮干的溫度為35-60 ℃；其中，冰乙酸溶液的體積百分比濃度為1%-10%，體積為0.2-1mL；

（8）在剩余的冰乙酸溶液中加入適量正己烷，渦旋1-3 min，3000-8000 g離心5-10min，棄去正己烷；其中，剩余冰乙酸溶液和正己烷的體積比為（0.2-1）:（4-10）；

（9）將剩余的冰乙酸溶液用空氣流吹至體積約0.1 mL，空氣流揮干的溫度為35-60 ℃；

（10）將上述冰乙酸溶液和氟苯尼考胺標準品分別點樣于同一塊GF-254硅膠薄層板的不同位置，于體積比乙酸乙酯:丙酮:氨水等于2:8: 0.5的混合液展開至頂端；

（11）將GF-254硅膠薄層板取出，待溶劑揮干后于254-360 nm下檢視，根據氟苯尼考胺標準品的展開距離標記組織提取液中氟苯尼考胺的大致位置，刮取對應位置的硅膠；

（12）于刮取的硅膠中加入體積比20:80-80:20的乙腈-冰乙酸混合液0.5-5 mL，渦旋，離心，取上清，通過0.22 μm有機濾膜過濾，其中，乙腈-冰乙酸混合溶液中冰乙酸的體積百分比濃度為1%-10%；

（13）將過濾后的樣品通過高效液相色譜檢測氟苯尼考胺的含量；其中，高效液相色譜流動相為乙腈與磷酸鹽緩沖液按體積比為33.3:66.7組成的混合液；每500mL磷酸鹽緩沖液含0.34g十二烷基磺酸鈉、0.78g二水磷酸氫二鈉、0.5mL三乙胺和0.5mL磷酸；

高效液相色譜的條件為：色譜分離在Waters Symmetry C₁₈色譜柱內完成，柱溫為32-40℃，流速為0.5-1 mL/min，檢測波長為220-230 nm。

2.一種豬可食性組織中氟苯尼考總殘留物的定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

1）檢測豬可食性組織中氟苯尼考總殘留物：采用權利要求1所述的檢測豬可食性組織中氟苯尼考總殘留物的方法中的步驟（1）～（13）；

2）稱取5-20 mg氟苯尼考胺的標準品加到10 mL容量瓶中，用乙睛溶解、定容、搖勻，備用；取供試標品，以步驟1）中第（13）步流動相逐級稀釋成系列濃度，每濃度標品以10-50 μL進樣，重復三次，以氟苯尼考胺濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，得到回歸方程y =282116x + 9413.7，其中x為氟苯尼考胺濃度，y為峰面積；將步驟1）中第（13）步所測樣品經高效液相色譜檢測到的氟苯尼考胺峰面積帶入上述線性方程，經計算即可得到豬可食性組織中氟苯尼考胺殘留濃度。

3.一種薄層色譜分離豬可食性組織中氟苯尼考總殘留物的方法，其特征在于，包括權利要求1所述方法中的步驟（1）-（12）。

4.權利要求1所述的檢測豬可食性組織中氟苯尼考總殘留物的方法或權利要求2的定量檢測方法在檢測豬可食性組織中氟苯尼考的殘留的應用。