[發(fā)明專利]溶血性曼氏桿菌LKTA蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法及檢測溶血性曼氏桿菌的試劑盒在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910068476.1 | 申請日： | 2019-01-24 |
| 公開（公告）號： | CN111004812A | 公開（公告）日： | 2020-04-14 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張月梅;趙世華;宋越;戴伶俐;王娜;張帆;劉威;楊斌;達(dá)來寶力格;陳偉 | 申請（專利權(quán)）人： | 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C12N15/66;C12N15/31;C07K14/195;G01N33/569 |
| 代理公司： | 北京高沃律師事務(wù)所 11569 | 代理人： | 劉奇 |
| 地址： | 010000 內(nèi)蒙古*** | 國省代碼： | 內(nèi)蒙古;15 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 溶血 性曼氏 桿菌 lkta 蛋白 表達(dá) 載體 構(gòu)建 方法 檢測 試劑盒 | ||
本發(fā)明提供了溶血性曼氏桿菌LKTA蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法及檢測溶血性曼氏桿菌的試劑盒，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，包括以下步驟：1)以lkta?F、lkta?R為引物，以溶血性曼氏桿菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；2)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒載體分別進(jìn)行酶切，得到LKTA蛋白編碼基因酶切片段和質(zhì)粒載體酶切片段；3)將所述LKTA蛋白編碼基因酶切片段和載體酶切片段連接，得到重組質(zhì)粒；4)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的感受態(tài)中，得到溶血性曼氏桿菌LKTA蛋白原核表達(dá)載體。本發(fā)明提供的溶血性曼氏桿菌LKTA蛋白具有良好的特異性，能夠用來作為抗原標(biāo)志物檢測溶血性曼氏桿菌。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及溶血性曼氏桿菌LKTA蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法及檢測溶血性曼氏桿菌的試劑盒。
背景技術(shù)
溶血性曼氏桿菌原名溶血性巴氏桿菌，是一種革蘭氏陰性，不運動，無芽孢，氧化酶陽性，瑞士染色兩極著色的兼性厭氧球桿狀菌。在血液瓊脂上，新分離的菌落呈微弱的β溶血。基于發(fā)酵阿拉伯糖和海藻糖的能力進(jìn)一步分為兩個不同的生物型(A，T)。十二個A生物型(血清型1、2、5、6、7、8、9、12、13、14、16、17)和四個T生物型(血清型3、4、10、15)已被鑒定。溶血性曼氏桿菌是一種嚴(yán)重危害家畜養(yǎng)殖業(yè)的人畜共患病，臨床上可以導(dǎo)致牛羊出血性敗血癥等危害嚴(yán)重的病癥。一般認(rèn)為它是家畜家常帶內(nèi)源性病菌，當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境不衛(wèi)生，加上由于天氣的突變、寒冷、悶熱、潮濕擁擠、飼養(yǎng)營養(yǎng)缺乏、飼料突變、長途運輸?shù)日T因，動物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體抵抗力降低，病菌可乘機(jī)侵入機(jī)體內(nèi)，經(jīng)淋巴進(jìn)入血液，發(fā)生內(nèi)源性感染。
目前對于溶血性曼氏桿菌的檢測多采用PCR擴(kuò)增的方法，例如中國專利CN201810149979.7，一種用于檢測溶血性曼氏桿菌實時熒光PCR引物，公開了采用熒光PCR的方法檢測血性曼氏桿菌。但是目前現(xiàn)有技術(shù)中沒有能夠有效的檢測溶血性曼氏桿菌的抗原標(biāo)志物，尚沒有檢測溶血性曼氏桿菌的免疫學(xué)方法。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種溶血性曼氏桿菌LKTA蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法及檢測溶血性曼氏桿菌的試劑盒；所述LKTA蛋白原核表達(dá)載體能夠表達(dá)高免疫活性的LKTA蛋白，能夠?qū)崿F(xiàn)溶血性曼氏桿菌的免疫檢測。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：
溶血性曼氏桿菌LKTA蛋白原核表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
1)以lkta-F、lkta-R為引物，以溶血性曼氏桿菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到LKTA蛋白編碼基因的PCR產(chǎn)物；
所述lkta-F具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；
所述lkta-R具有如序列表中SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
2)將所述LKTA蛋白編碼基因的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體分別進(jìn)行NdeI和XhoI酶切，得到LKTA蛋白編碼基因酶切片段和質(zhì)粒載體酶切片段；
3)將所述LKTA蛋白編碼基因酶切片段和載體酶切片段連接，得到重組質(zhì)粒；
4)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的感受態(tài)中，得到溶血性曼氏桿菌LKTA蛋白原核表達(dá)載體。
優(yōu)選的，所述步驟1)中PCR擴(kuò)增的程序如下：95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃1min，30循環(huán)；72℃7min。
優(yōu)選的，步驟1)中PCR擴(kuò)增的體系以50μl計，包括如下組分：
優(yōu)選的，所述步驟3)中連接采用無縫克隆法進(jìn)行。
優(yōu)選的，所述連接的體系以20μl計，包括如下組分：
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