[發(fā)明專利]一種甘油-2-α-葡萄糖基化酶在制備2-α-甘油葡萄糖苷中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910066879.2
• 申請日: 2019-01-24
• 公開（公告）號: CN109988799B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳小龍;江丹;朱林江;陸躍樂;范永仙;陳翰馳
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12P19/44
• 分類號: C12P19/44;C12P19/14;C12N15/70;C12N15/53;C12N9/24
• 代理公司: 杭州天正專利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發(fā)明公開了一種甘油?2?α?葡萄糖基化酶在制備2?α?甘油葡萄糖苷中的應(yīng)用，所述甘油?2?α?葡萄糖基化酶氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示；本發(fā)明所述生產(chǎn)2?α?GG的重組大腸桿菌，即重組大腸桿菌(Escherichia coli)IEF?bpmsp208能夠在胞內(nèi)高效合成蔗糖磷酸化酶，以甘油和蔗糖為底物，高效催化甘油的糖基化反應(yīng)，反應(yīng)18?24小時，可得到大于10％的2?α?GG溶液，且對底物蔗糖的轉(zhuǎn)化率大于92％，2?α?GG的產(chǎn)物濃度高，轉(zhuǎn)化率高，有利于2?α?GG分離純化。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種含甘油-2-α-葡萄糖基化酶在生產(chǎn)2-α-甘油葡萄糖苷(2-O-α-D-glucosylglycerol，以下簡稱2-α-GG)中的應(yīng)用。

(二)背景技術(shù)

2-α-甘油葡萄糖苷(2-α-GG)是一類由甘油分子與葡萄糖分子以糖苷鍵結(jié)合的物質(zhì)，結(jié)構(gòu)式如圖1所示，其通過糖苷鍵將一個D-吡喃葡萄糖和甘油2號位的羥基偶聯(lián)，是自然界多種植物、藻類和細菌對抗干旱和高鹽環(huán)境的天然保護劑。葡萄糖分子的構(gòu)型結(jié)合甘油分子的位置分為多種，目前已經(jīng)鑒定出六種，但作為天然滲透壓抵抗分子的是2-α-GG。它是微生物在脅迫條件下合成的一種滲透保護物質(zhì)，同時還是一種大分子穩(wěn)定劑，能夠在高溫或冷凍干燥條件下穩(wěn)定蛋白質(zhì)或酶等生物大分子結(jié)構(gòu)，也可用于蛋白質(zhì)藥物等的長期保存；由于具有低吸水性、高保濕性的特點，用于提高皮膚保濕效果，是一種良好的化妝品添加劑，抗氧化和抗衰老等功效。更有研究發(fā)現(xiàn)2-α-GG還具有治療過敏性呼吸系統(tǒng)疾病等多種人體保健功效。

2-α-GG在化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用前景，但局限于2-α-GG的生產(chǎn)技術(shù)，高純度的產(chǎn)品價格高居不下。目前的生產(chǎn)方法包括化學(xué)法合成、酶法合成和植物或藻類中直接提取。其中化學(xué)法缺乏立體和區(qū)域?qū)Ｒ恍裕a(chǎn)物多樣，得率低；許多酶法轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物亦含有多個糖基化位點的產(chǎn)物，難以得到單一產(chǎn)品2-α-GG；直接提取的方法，其得率太低，成本高，難以產(chǎn)業(yè)化。目前，2-α-GG的生產(chǎn)技術(shù)側(cè)重于篩選專一性更好的酶法轉(zhuǎn)化和微生物代謝工程直接發(fā)酵生產(chǎn)。

(三)發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是提供一種甘油-2-α-葡萄糖基化酶在制備2-α-GG中應(yīng)用，實現(xiàn)了用酶法高效、專一性的生產(chǎn)2-α-GG。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種甘油-2-α-葡萄糖基化酶在制備2-α-甘油葡萄糖苷(2-α-GG)中的應(yīng)用，所述甘油-2-α-葡萄糖基化酶氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示，編碼基因核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。所述甘油-2-α-葡萄糖基化酶來源于Leuconostocpseudomesenteroides。

本發(fā)明所述甘油-2-α-葡萄糖基化酶在制備2-α-甘油葡萄糖苷(2-α-GG)中的應(yīng)用方法為：將含甘油-2-α-葡萄糖基化酶基因的重組大腸桿菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液或發(fā)酵離心的濕菌體用緩沖液懸浮的菌懸液為催化劑，以甘油為底物，以蔗糖為輔助底物，在30-45℃的條件下進行反應(yīng)，獲得含2-α-甘油葡萄糖苷的反應(yīng)液，將反應(yīng)液分離純化，獲得2-α-甘油葡萄糖苷。所述發(fā)酵液或菌懸液中濕菌體含量為5-100g/L(優(yōu)選30-50g/L)，甘油的終濃度為100-150g/L(優(yōu)選120-140g/L)，蔗糖終濃度為300-400g/L(優(yōu)選330-350g/L)。

進一步，所述反應(yīng)pH為6.0-8.0，反應(yīng)時間為24h。

進一步，所述緩沖液為pH7.0、2.5mM磷酸緩沖液。

本發(fā)明所述重組大腸桿菌構(gòu)建方法：將SEQ ID NO.1所示甘油-2-α-葡萄糖基化酶基因(lpmsp)克隆到pET28a質(zhì)粒上，構(gòu)建pET28a-lpmsp重組表達質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli BL21(DE3)中，得到重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)(pET28a-lpmsp)。