[發明專利]高產9α-OH-AD的偶發分枝桿菌及其應用

有效

• 申請號: 201910066720.0
• 申請日: 2019-01-24
• 公開（公告）號: CN109652338B
• 公開（公告）日: 2021-04-09
• 發明（設計）人: 王敏;申雁冰;周海杰;龍科藝;駱健美;夏夢雷;屠琳娜;馬賽
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P33/00;C12R1/33
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于甾體生物轉化技術領域，具體涉及一株能有效降解植物甾醇側鏈高產9α?OH?AD的偶發分枝桿菌及其應用。所述偶發分枝桿菌是一株經物理化學復合誘變獲得的誘變菌株，其9α?OH?AD生成率最高可達97％；10g/L植物甾醇底物濃度下，9α?OH?AD生成率最為95.7％，是出發菌株的1.21倍，生物轉化時間為72h，較出發菌株縮短24h，是目前現有技術中，以植物甾醇為底物生產9α?OH?AD轉化率最高，轉化時間最短的分枝桿菌，具有良好的工業化應用前景。

技術領域：

本發明屬于甾體生物轉化技術領域，具體涉及一株能有效降解植物甾醇側鏈高產9α-OH-AD的偶發分枝桿菌及其應用。

技術背景：

9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9α-hydroxyandrost-4-ene-3,17-dione，9α-OH-AD)是生產9α位上有鹵素的皮質激素的重要前體，對機體起著非常重要的調節作用，許多甾體激素類藥物都是以9α-OH-AD為起始原料進行生產的；利用9α-OH-AD可以合成氫化可的松、17α-羥基黃體酮、依普利酮、地塞米松、倍他米松、可的松、醋酸氟輕松、氟羥潑尼松龍等多種重要的甾體藥物，具有重要的商業價值。

分枝桿菌、節桿菌及棒桿菌等很多微生物都能以植物甾醇作為碳源產生9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮等代謝中間體，通過微生物轉化法生產9α-羥基雄甾-4-烯-3,17-二酮可以充分利用長期以來被用作廢物的植物甾醇，擺脫了原材料來源對生產的制約，同時對保護自然資源和生態環境起到了很好的作用。但微生物對植物甾醇的轉化過程仍存在很多限制因素，甾體化合物疏水性強，在水中的溶解度低；菌株轉化能力普遍較低，高濃度底物投加量對轉化過程的抑制等，因此提高菌株的轉化能力，改善菌種對底物的耐受性進而提高投料濃度等都是甾體生物轉化中要解決的關鍵問題。

為了提高微生物對植物甾醇的轉化效力和產物產量，紫外、DES等物理和化學誘變及高濃度底物馴化培養方法常被用來選育優良菌株。吳寶華等用紫外照射和NTC復合誘變的方法處理節桿菌，經篩選獲得一株ADD分解酶缺陷型菌株，能有效積累ADD，該菌株對豆甾醇的降解率達到95％，ADD產率達45％左右。楊英等分別采用紫外線照射、⁶⁰Co、紫外線與⁶⁰Co復合誘變處理出發菌株Mycobaterium sp.BD696，篩選得到一高轉化率突變株，其AD產量較出發菌株提高39.2％，且沒有結構類似物ADD產生。黃麗君等以一株降解植物甾醇產生雄烯二酮的分枝桿菌為研究對象，先后利用亞硝基胍(NTG)和N⁺注入技術對其進行誘變處理，最終選育出一株高產突變株Mycobaterium sp.N-2，其雄烯二酮生產能力較出發菌株提高了37.8％。Vidal等在含有14g/Lβ-谷甾醇的培養基中反復培養分枝桿菌Mycobateriumsp.MB-3683和Mycobaterium sp.B-11045，連續轉接培養7次后，兩株菌對谷甾醇的轉化率分別提高了44％和21％。英國專利GB1530730公開的以亞硝基胍誘變處理偶發分枝桿菌ATCC6842選育出具有9α-羥基化酶的突變菌株偶發分枝桿菌Mycobacterium fortuitumNRRL B-8119，該突變菌株能夠轉化谷甾醇、膽固醇或豆甾醇生成9α-OH-AD，但轉化周期長達336小時，且底物轉化率極低，只能得到微量產物9α-OH-AD。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種可高產9α-OH-AD的偶發分枝桿菌及其應用，該菌株可以以植物甾醇為底物，有效降解植物甾醇側鏈高產9α-OH-AD。植物甾醇的投加濃度可達10g/L，9α-OH-AD的生成率可達97％。

所述偶發分枝桿菌具體為偶發分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)ARL-91，該菌株已于2018年11月22日，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101，保藏編號為CGMCC NO.16771。