[發(fā)明專利]化學試劑增加水稻等位基因替換編輯效率在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201910065467.7 | 申請日： | 2019-01-24 |
| 公開（公告）號： | CN109811002A | 公開（公告）日： | 2019-05-28 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 魏娟;劉春霞;李相敢 | 申請（專利權(quán)）人： | 先正達參股股份有限公司;先正達生物科技（中國）有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;A01H5/00;A01H6/46 |
| 代理公司： | 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務(wù)所 11038 | 代理人： | 傅宇昌 |
| 地址： | 瑞士*** | 國省代碼： | 瑞士;CH |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 等位基因 替換 化學試劑 水稻基因 申請 水稻 基因 | ||
本申請涉及基因編輯領(lǐng)域，特別地涉及水稻基因編輯中的等位基因替換。本申請使用化學試劑來增加水稻等位基因替換編輯效率。特別地，本申請涉及使用化學試劑例如化合物SCR7或RS?1來增加在水稻基因編輯中的等位基因替換效率的用途和方法。
技術(shù)領(lǐng)域
本申請涉及基因編輯領(lǐng)域，特別地涉及水稻基因編輯中的等位基因替換。本申請?zhí)岣吡怂局械任换蛱鎿Q編輯的效率。
背景技術(shù)
基因編輯技術(shù)，特別是以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術(shù)，是遺傳研究領(lǐng)域革命性的技術(shù)。它在植物基因功能研究和作物遺傳育種方面發(fā)揮了重大的作用。基因編輯主要是通過不同的序列特異核酸酶(ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1)在基因組特定位置產(chǎn)生雙鏈斷裂，進而通過自身的非同源末端連接或者是同源重組機制，實現(xiàn)對基因組的修飾，包括缺失、插入和替換等。
基因替換編輯技術(shù)是基因編輯技術(shù)中的一種，它是通過核酸酶介導對目標基因進行替換的編輯技術(shù)，特別是基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)，可以在基因組靶向位點處產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DSB)，以人為提供的外源供體DNA為模板，通過同源重組(HR)介導的DNA修復途徑來實現(xiàn)對目標基因的替換。與插入缺失的突變相比，基因替換編輯技術(shù)在農(nóng)作物遺傳改良與基因功能鑒定中具有更重要的作用和實際應(yīng)用價值。
同源重組修復是一種精確的修復方式，對于維持基因組的完整性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。但是在真核生物中，非同源末端連接修復效率遠遠大于同源重組的修復效率，所以真核生物中基因替換具有很大的挑戰(zhàn)性，也是基因編輯領(lǐng)域研究的一個熱點。同源重組修復主要發(fā)生在細胞的G2期和S期[1]，在整個G1期幾乎沒有同源重組修復。Gutschner等人利用蛋白質(zhì)工程方法，直接同步Cas9的表達與細胞周期，控制基因組的時空編輯，來增加同源重組的效率[2]。Yang等人也證實將細胞同步在G2/M期后基因敲入的效率會增加3到6倍[3]。
Cpf1作為新一代的基因編輯工具，有很多與CRISPR/Cas9不同的優(yōu)勢，其中Cpf1剪切之后產(chǎn)生的是粘性末端，這有會更有利于基因的定點插入。Begemann等人曾在水稻中用Cpf1做基因定點插入，效率達到了8％，這是其他的核酸酶都沒法達到的效率[4]。
基因替換編輯技術(shù)中關(guān)鍵的一步是產(chǎn)生雙鏈斷裂的同時能將DNA模板遞送到位，Butt等人應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將模板串聯(lián)在gRNA的后面，這樣在產(chǎn)生雙鏈斷裂的同時，模板可以及時地用來修復，從而提高基因替換的效率[5]。
雙生病毒科病毒是一類具有環(huán)狀單鏈DNA(circular single strand DNA)基因組的植物病毒，寄主范圍廣泛，包括單子葉和雙子葉植物。基因組大小為2.5-3.0kb，病毒感染寄主細胞后會通過滾環(huán)復制產(chǎn)生大量的DNA復制子，可作為同源重組修復的模板。Baltes等人最早將雙生病毒復制子用于提高植物基因替換編輯的效率，與傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相比，菜豆黃矮病毒(Bean yellow dwarf virus，BeYDV)的復制子可以將基因替換的效率提高一到兩個數(shù)量級[6]。隨后他們實驗室又將這一技術(shù)應(yīng)用到西紅柿上，創(chuàng)造了可遺傳的基因敲入后代，與傳統(tǒng)的DNA導入方法相比，基因敲入的效率提高了10倍[7]。同樣地，菜豆黃矮病毒復制子也被應(yīng)用于馬鈴薯，用來提高基因替換的效率[8]。Gil-Humanes等人在小麥中利用小麥矮縮病毒(Wheat dwarf virus，WDV)用于DNA模板復制，將基因敲入的效率大大提高，在報告系統(tǒng)中效率提高了110倍，在一個內(nèi)源基因位點效率也提高到原來的12倍[9]。Wang等人將小麥矮縮病毒的系統(tǒng)引入到水稻上用于基因替換編輯，使基因替換編輯的效率達到了19.4％[10]。
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