[發明專利]一種能同時檢測DNA和RNA的多重熒光PCR預存凍干試劑

在審

• 申請號: 201910055286.6
• 申請日: 2019-01-21
• 公開（公告）號: CN109735655A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 劉白朵;方琴;張健;蔣淼
• 申請（專利權）人: 上海科華生物工程股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 上海世圓知識產權代理有限公司 31320
• 代理人: 陳穎潔;王佳妮

本發明提供了一種能同時檢測DNA和RNA的多重熒光PCR預存凍干試劑，包含逆轉錄酶，DNA聚合酶；PCR緩沖液；Mg²⁺；dNTP；凍干保護劑。本發明能在同一反應管里同時針對DNA和RNA兩種不同類型的核酸進行多重熒光PCR擴增檢測，可以解決在針對不同類型的核酸，需要多次擴增的情況，節省了時間和耗材成本。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種檢測試劑，具體來說是一種能同時檢測DNA和RNA 的多重熒光PCR預存凍干試劑。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種體外擴增技術，是在模板核酸、引物和脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于聚合酶的酶促反應，將待擴增的DNA片段經反復循環，在短時間內獲得大量的特定基因片段。具有靈敏高、特異性強等優點，目前廣泛應用于核酸診斷領域。

熒光PCR(Real-time PCR),又稱實時熒光PCR，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行總量分析或通過Ct值對模板進行相對定量。熒光PCR根據化學原理的不同可分為探針法和染料法。其中， Taqman熒光定量技術以Taqman熒光探針為基礎，此探針為一寡核苷酸，在序列的5’端標記有一個熒光發射基團，在3’端標記有一個淬滅基團，探針完整時，發射基團的熒光信號被淬滅基團吸收，當PCR擴增時，由于Taq酶的外切酶作用使探針發生降解，從而使熒光基團發出熒光，熒光PCR儀通過探測熒光信號的積累而對樣品進行檢測。

多重熒光PCR(multiplex PCR),又稱多重引物熒光PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系里加上兩對以上的引物、探針，從而對兩種或兩種以上的不同核酸片段進行PCR擴增。多重PCR主要用于多種病院微生物的同時檢測或鑒定某些病原微生物、某些遺傳病。目前，基于熒光探針的多重熒光PCR試劑基本都是對同一種類型的核酸進行檢測，如都針對DNA類的核酸進行多重熒光PCR，或都針對RNA類的核酸進行多重熒光PCR。

傳統用于DNA和RNA的熒光PCR檢測試劑多為液態的單重檢測試劑，一個反應體系只能檢測一個靶標，檢測項目單一、耗材和試劑成本高，檢測通量低。同時，由于是液體狀態試劑，在運輸過程中，需要低溫保存運輸，增加了運輸的成本及復雜性。

目前的PCR擴增試劑基本呈液體狀態，在常溫下保存并不穩定，尤其是RNA反應試劑。而且液體試劑每次使用都需要反復凍融，對試劑的活性有很大影響，對PCR試劑長途運輸會受到很大的影響，容易因溫度不當導致試劑性能下降。本發明的可同時檢測DNA和RNA的多重 PCR預凍試劑可有效克服上述缺點。

發明內容

針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種能同時檢測DNA和RNA的多重熒光 PCR預存凍干試劑，所述的這種能同時檢測DNA和RNA的多重熒光PCR預存凍干試劑要解決現有技術中的用于DNA和RNA的熒光PCR檢測試劑只能檢測一個靶標/檢測項目單一、耗材和試劑成本高/檢測通量低、而且運輸不方便的技術問題。

本發明提供了一種能同時檢測DNA和RNA的多重熒光PCR預存凍干試劑，包含以下組份：

逆轉錄酶，所述的逆轉錄酶的終濃度為0.02U/ul-0.2U/ul；

DNA聚合酶，所述的DNA聚合酶的終濃度為0.05U/ul-0.1U/ul；

PCR緩沖液，所述的PCR緩沖液由終濃度為10mM-50mM的KCl、終濃度為5mM-30mM 的Tris-HCl、終質量百分比濃度為0.005％-0.05％Tween20組成；

Mg²⁺，所述的Mg²⁺的終濃度為1.5mM-5mM；

dNTP，所述的dNTP的終濃度為0.1mM-0.5mM；