[發(fā)明專利]一種無(wú)痕跡木霉真菌基因過(guò)表達(dá)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910045672.7
• 申請(qǐng)日: 2018-02-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109666690B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-05-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈其榮;繆有志;黃啟為;梅慧玲;夏燕維
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N15/90;C12N15/60;C12R1/885
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

1.一種無(wú)痕跡木霉真菌基因過(guò)表達(dá)方法，其特征在于所述的方法包括：過(guò)表達(dá)采用的目的基因以及其過(guò)表達(dá)所需的強(qiáng)啟動(dòng)子均為木霉的內(nèi)源片段，通過(guò)融合PCR將U3表達(dá)框和目的基因過(guò)表達(dá)框融合成一個(gè)完整的片段通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將過(guò)表達(dá)片段轉(zhuǎn)入無(wú)痕敲除ura3基因的木霉突變體中并篩選出正確的突變體；

所述的過(guò)表達(dá)片段通過(guò)以下方法構(gòu)建:強(qiáng)啟動(dòng)子序列通過(guò)引物P_F： SEQ ID NO.33和引物P_R： SEQ ID NO.34從NJAU4742基因組DNA中擴(kuò)增得到；過(guò)表達(dá)的目的基因完整序列和過(guò)表達(dá)的目的基因完整終止子序列通過(guò)PCR從NJAU4742基因組DNA中擴(kuò)增得到；U3表達(dá)框通過(guò)引物U3box_F： SEQ ID NO.37和U3box_R： SEQ ID NO.38從NJAU4742基因組DNA中擴(kuò)增得到，通過(guò)融合PCR步驟獲得最終過(guò)表達(dá)片段產(chǎn)物；融合PCR第一步反應(yīng)體系中HiFi Premix10 μl，四種片段各2 μl，ddH₂O 2 μl，反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 1s，（98℃ 10s，60℃ 7s，72℃40s）_{15個(gè)循環(huán)}，4℃保存;融合PCR第二步反應(yīng)體系中HiFi Premix 25 μl，第一步反應(yīng)產(chǎn)物4 μl，U3_upF和U3_geneR引物各2 μl，ddH₂O 17 μl，反應(yīng)程序?yàn)?8℃ 1s，（98℃ 10s，60℃ 7s，72℃ 40s）_{30個(gè)循環(huán)}，4℃保存；

所述的無(wú)痕敲除ura3基因的木霉突變體，按照以下方法構(gòu)建得到：針對(duì)ura3基因序列設(shè)計(jì)四對(duì)引物：其中，一對(duì)引物擴(kuò)增ura3基因起始密碼子ATG上游的1-1.5kb序列，為上游片段；一對(duì)引物擴(kuò)增上游片段到ura3基因起始密碼子ATG之間的1-1.5kb序列，為基因片段；一對(duì)引物擴(kuò)增目的基因終止密碼子下游的500-800bp序列，為下游片段；最后一對(duì)引物擴(kuò)增潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶基因完整表達(dá)框，命名為HygB抗性基因表達(dá)框；上述四種不同片段之間通過(guò)引物設(shè)計(jì)使得相鄰兩片段之間具有25bp的末端重合區(qū)域，其中，上游片段末端與下游片段起始端重合；下游片段末端與HygB抗性基因表達(dá)框起始端重合；HygB抗性基因表達(dá)框末端與ura3基因片段起始端重合；利用高保真酶從木霉基因組上分別通過(guò)PCR擴(kuò)增得到上游片段、下游片段、ura3基因片段，從pcDNA1質(zhì)粒上PCR擴(kuò)增得到HygB抗性基因表達(dá)框；通過(guò)融合PCR獲得上游片段+下游片段+HygB抗性基因表達(dá)框+ ura3基因片段的ura3基因敲除片段；將該ura3基因敲除片段轉(zhuǎn)化木霉原生質(zhì)體獲得突變體；在含有HygB的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)突變體，對(duì)能夠在含有HygB的PDA培養(yǎng)上生長(zhǎng)的木霉利用菌絲裂解試劑盒進(jìn)行突變體第一次同源重組驗(yàn)證，保留發(fā)生正確同源重組的突變體菌株，并讓其繼續(xù)生長(zhǎng)至產(chǎn)孢；將上述發(fā)生第一次同源重組的正確突變體的孢子涂布于含有1.5 mg/ml 5-FOA、5 nmol 尿苷的GSM固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)生二次同源重組的片段能夠在含有5-FOA和尿苷的GSM平板上萌發(fā)并長(zhǎng)出菌塊，挑取陽(yáng)性突變體并進(jìn)行純化驗(yàn)證后得到無(wú)痕敲除ura3基因的木霉突變體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)痕跡木霉真菌基因過(guò)表達(dá)方法，其特征在于其特征在于包括以下步驟：

（1）過(guò)表達(dá)片段構(gòu)建

（2）過(guò)表達(dá)片段轉(zhuǎn)化

通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化將過(guò)表達(dá)片段轉(zhuǎn)入無(wú)痕敲除ura3基因的木霉突變體中；

（3）過(guò)表達(dá)突變子篩選、純化及qPCR驗(yàn)證

上述雙層篩選平板于28℃培養(yǎng)培養(yǎng)48-72 h后，會(huì)在上層GSM培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出明顯的圓形菌落，將其轉(zhuǎn)接到新的GSM固體平板上，利用菌絲裂解試劑盒提取突變體DNA，通過(guò)PCR驗(yàn)證過(guò)表達(dá)片段是否被正確插入基因組中獲得過(guò)表達(dá)突變體，突變體能夠在不添加尿苷或尿嘧啶的GSM培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，ura3基因的得到正確回補(bǔ)；

將過(guò)表達(dá)突變體和原始菌株NJAU4742在GSM液體培養(yǎng)基中發(fā)酵，回收二者菌絲體，提取突變體和原始菌株總RNA，將總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后，利用定量PCR試劑盒進(jìn)行過(guò)表達(dá)目的基因轉(zhuǎn)錄水平的驗(yàn)證。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)痕跡木霉真菌基因過(guò)表達(dá)方法，其特征在于所述的木霉為含有ura3基因的木霉。