[發明專利]基于高分辨率熔解的多重環介導等溫核酸擴增檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201910033420.2
• 申請日: 2019-01-14
• 公開（公告）號: CN109504744B
• 公開（公告）日: 2022-11-29
• 發明（設計）人: 徐秦峰;張文娟;董菁
• 申請（專利權）人: 陜西科技大學
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司 61200
• 代理人: 范巍

1.一種基于高分辨率熔解的非疾病診斷多重環介導等溫核酸擴增檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

1)靶序列單重LAMP擴增

根據各目標檢測物樣品中待檢測目的基因的不同選取靶序列并針對各個靶序列設計對應的特異性引物，提取目標檢測物樣品內的DNA，將該DNA作為模板；將模板及對應引物進行單重LAMP擴增反應，根據反應結果確定LAMP擴增反應的反應體系；

2)多重LAMP反應條件優化

將步驟1)涉及的目標檢測物樣品兩兩進行組合，然后針對組合后對應的兩個模板同時進行LAMP擴增反應，擴增反應后獲取高分辨率熔解曲線，然后根據對應兩個擴增產物的解鏈峰的差異程度優化所述擴增反應的反應條件；將不同目標檢測物樣品組合對應的反應條件的優化結果通過取交集進行合并，得到多重LAMP擴增反應的反應條件；

所述步驟2)中，優化所述擴增反應的反應條件具體包括以下步驟：確定兩個模板同時擴增所得擴增產物的熔解溫度差異，若所述熔解溫度差異3℃，選取使該兩個模板對應解鏈峰面積相等時的反應溫度為優化的反應溫度，若所述熔解溫度差異≤3℃，選取使該兩個模板的擴增產物的歸一化高分辨率熔解曲線位于對應單個模板擴增產物的歸一化高分辨率熔解曲線之間時的反應溫度為優化的反應溫度，當混合模板樣品歸一化高分辨率熔解曲線位于對應兩個單模板樣品對照正中間時，則兩靶標都實現了擴增，且擴增效率接近；

3)多重擴增檢測

經過步驟2)后，提取待測樣品中的DNA，并以該DNA為模板進行多重LAMP擴增反應，擴增反應后獲取高分辨率熔解曲線，然后對高分辨率熔解曲線進行歸一化，然后與同樣采用歸一化構建得到的在不同目標檢測物樣品間互不重疊的標準高分辨率熔解曲線模型進行比對，根據比對結果，鑒別待測樣品所含單個靶序列或多個靶序列；多重LAMP擴增反應選自三重以上LAMP擴增反應。

2.根據權利要求1所述的多重環介導等溫核酸擴增檢測方法，其特征在于：所述DNA的提取采用試劑盒法。

3.根據權利要求1所述的多重環介導等溫核酸擴增檢測方法，其特征在于：所述標準高分辨率熔解曲線模型的構建方法具體包括以下步驟：對步驟1)涉及的目標檢測物樣品所對應的每個模板，分別使用針對全部靶序列的引物進行多重LAMP擴增反應，然后獲取高分辨率熔解曲線，并分別采用歸一化對對應高分辨率熔解曲線輪廓進行特征提取。

4.根據權利要求1所述的多重環介導等溫核酸擴增檢測方法，其特征在于：所述靶序列選自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的fem基因、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)的virR基因、沙門氏菌屬的invA基因中的一種或多種。

5.根據權利要求1所述的多重環介導等溫核酸擴增檢測方法，其特征在于：所述步驟3還包括以下步驟：對高分辨率熔解曲線進行主成分分析。