[發明專利]一種表達人胰島素基因的重組乳酸乳球菌

在審

• 申請號: 201910029031.2
• 申請日: 2019-01-12
• 公開（公告）號: CN109679964A
• 公開（公告）日: 2019-04-26
• 發明（設計）人: 李明義;劉陽;單學強;周霞;王艷;于澤坤;欒志舫;李思菲;只勇
• 申請（專利權）人: 青島華義宏博生物科技有限公司;山東信得科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/17
• 分類號: C12N15/17;C12N15/16;C12N15/74;C12N1/21;A61K48/00;A61P3/10;C12R1/01
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明提供一種分泌表達人胰島素和Exendin?4的重組乳酸乳球菌MG1363。本發明構建了用于表達人胰島素基因和Exendin?4基因的專用重組乳酸乳球菌。培養和發酵該重組乳酸菌即可實現人胰島素基因和Exendin?4基因在乳酸菌表面展示表達。實驗證明，本發明的重組乳酸菌能夠正確的在其表面對人胰島素基因和Exendin?4基因進行展示表達，定位于重組乳酸菌表面的重組人胰島素具有與天然胰島素十分相似的空間結構，其可以與胰島素多克隆抗體發生特異性結合，定位于重組乳酸菌表面的Exendin?4和GLP?1具有相同的生理功能，作用于相同的受體，還發現Exendin?4比GLP?1與受體的親和性更高。

技術領域

本發明屬于功能蛋白重組表達技術領域，具體涉及一種表達人胰島素基因的重組乳酸乳球菌工程菌。

背景技術

糖尿病是由于機體內胰島素分泌缺陷或/和胰島素抵抗而引起的糖、脂、蛋白質代謝紊亂的一種慢性內分泌代謝疾病。糖尿病主要包括三種類型，I型糖尿病(Type Idiabetes mellitus,T1DM)、Ⅱ型糖尿病(Type II diabetes mellitus,T2DM)和妊娠糖尿病(Gestational Diabetes Mellitus,GDM)。I型糖尿病是一種自身免疫性疾病，是自身的T細胞過度反應從而選擇性破壞胰腺中產胰島素的P細胞，從而導致胰島素的絕對缺乏。I型糖尿病多見于兒童和青少年，需要靠每天注射胰島素來控制血糖，沒有胰島素，患者將無法生存，故該病也稱為胰島素依賴性糖尿病。Ⅱ型糖尿病又稱為非胰島素依賴型糖尿病，體內的胰島細胞破壞并不嚴重，仍然能夠產生一定量的胰島素，但機體對胰島素產生抵抗，從而導致胰島素出現相對不足，主要發病糖尿病后期會導致嚴重的并發癥。妊娠糖尿病是在妊娠期間被診斷的糖尿病，可能會對嬰兒造成一定的影響。

針對I型糖尿病，有研究表明通過給T1DM的模型非肥胖糖尿病(Non-obesediabetic，NOD)小鼠口服胰島素能夠減輕或延緩其發病過程，其機制是抗原通過黏膜Peyer’s區吸收，從而激活免疫系統，之后與耐受性相關的效應T細胞被激活，引發口服耐受性，從而保護胰島素不被損傷。但是如果直接口服抗原，因為抗原絕大多數都是蛋白質，蛋白質在口服過程中經過胃腸環境的影響，會發生明顯的降解，因此嚴重影響抗原的有效作用效率。因此需要一種能夠達到食品級要求的運輸載體來降低或減輕抗原在經過腸胃環境時所受的損傷。

GLP-1是人體內分泌的一種胰高血糖素樣肽，其可以促進胰島素基因轉錄和胰島素分泌，提高受體對胰島素的敏感性，從而達到降低血糖水平的目的。GLP-1受體(GLP-1R)廣泛分布于胰島和其他組織如心臟、腎臟、肺、胃腸道和中樞神經系統的多個區域。GLP-1的功能由GLP-1R介導，GLP-1R可通過Ga_s、Ga_q、Ga_i和Ga₀介導細胞內多條信號通路發揮生理功能，GLP-1可促進胰島素的生物合成(從根本上解決胰島素缺乏問題)和分泌；可抑制胰島P細胞凋亡和促進其增殖(有助于恢復胰島細胞的功能)；可減緩胃排空和抑制食欲從而控制患者體重；增加外周組織對胰島素的敏感性；還具有保護心血管功能(可緩解糖尿病并發癥)，因此，GLP-1成為最理想的治療Ⅱ型糖尿病的藥物，正受到空前的關注。

盡管GLP-1抗糖尿病功能眾多，但由于其體內半衰期很短(1－2min)，很快會被體內廣泛存在的DPP-IV降解失去生物活性，因此天然形式的GLP-1不適合用來作為抗糖尿病的臨床藥物。