[發明專利]一種在細胞系中條件性敲除必需基因的方法

有效

• 申請號: 201910022784.0
• 申請日: 2019-01-10
• 公開（公告）號: CN109777830B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 王永明;王貝
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;王潔平

1.一種在細胞系中條件性敲除必需基因的方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）構建雙質粒系統，雙質粒系統包含KO質粒和Rescue質粒， KO質粒含有用于敲除內源基因的sgRNA和Cas9基因，用于調控外源基因表達的tTA基因和負責質粒在真核細胞中復制的EBNA1和oriP元件；Rescue質粒含有補償敲除的必需基因的外源補償基因，用于篩選轉染成功的細胞的抗藥基因和在EBNA1蛋白的作用下可以使質粒在真核細胞中復制的oriP元件；將靶向目的基因的sgRNA克隆到KO質粒上，將外源補償基因cDNA克隆到Rescue質粒上；

（2）將雙質粒系統轉染到細胞中，在藥物篩選下培養若干天，分選單克隆，測序鑒定，即篩選出必需基因純合敲除的細胞系；其中：

步驟（1）中，在Rescue質粒的sgRNA靶向序列和PAM序列上引入同義突變。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，Rescue質粒中的外源補償基因表達受Dox誘導調控。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，Rescue質粒還含有熒光素基因。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1）中，Rescue質粒中含有的抗藥基因是puromycin抗性基因、zencin抗性基因、Blast抗性基因或neomycin抗性基因中任一種。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（2）中，細胞選自成纖維細胞，胚胎干細胞，多潛能誘導多能干細胞ips，上皮細胞，成肌細胞，中國倉鼠卵巢細胞，人胚腎系293，幼倉鼠腎細胞，小鼠Sertoli細胞，猴腎細胞，人宮頸癌細胞，犬腎細胞，buffalo 大鼠肝細胞，人肺細胞，人肝細胞，小鼠乳腺瘤細胞，大鼠肝瘤細胞，HIH/3T3 細胞，人U2-OS 骨肉瘤細胞，人A549 細胞，人K562 細胞，人HEK293 細胞，人HEK293T 細胞，人HCT116 細胞，人MCF-7 細胞或TRI 細胞中任一種。

6.一種研究必需基因突變體功能的方法，其特征在于，其在權利要求1的步驟（1）和步驟（2）后，還包括構建另一個替換質粒Rescue2，再將Rescue2質粒轉染細胞系，用新的抗生素篩選， Recue質粒被替換為Rescue2，進而研究突變基因對細胞的影響；其中：替換質粒Rescue2包含與Rescue不同的抗性標記以及含有突變的外源基因，用于編碼帶有突變的必需基因。