[發明專利]一種SD大鼠皮層神經元培養方法

在審

• 申請號: 201910011692.2
• 申請日: 2019-01-07
• 公開（公告）號: CN109652373A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發明（設計）人: 范振峰;唐梅;李慧;賀永勝
• 申請（專利權）人: 云南洛宇生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0793
• 分類號: C12N5/0793
• 代理公司: 云南派特律師事務所 53110
• 代理人: 董建國

本發明提供了一種SD大鼠皮層神經元培養方法，本方法操作簡單，具有較高的可重復性；通過使用專用神經元培養基，皮層神經元生產效果好，保證了皮層神經元的純度。本發明能夠簡便、高效、經濟的獲得大量功能活性正常的SD大鼠皮層神經元，便于直接在純凈的體外細胞培養模型中進一步研究皮層神經元的生理功能。

技術領域

本發明涉及一種細胞的分離純化及培養方法，具體涉及一種SD大鼠皮層神經元培養方法。

背景技術

神經元是神經系統最基本的結構和功能單位。分為細胞體和突起兩部分。細胞體由細胞核、細胞膜、細胞質組成，具有聯絡和整合輸入信息并傳出信息的作用。突起有樹突和軸突兩種。樹突短而分枝多，直接由細胞體擴張突出，形成樹枝狀，其作用是接受其他神經元軸突傳來的沖動并傳給細胞體。軸突長而分枝少，為粗細均勻的細長突起，常起于軸丘，其作用是接受外來刺激，再由細胞體傳出。軸突除分出側枝外，其末端形成樹枝樣的神經末梢。末梢分布于某些組織器官內，形成各種神經末梢裝置。感覺神經末梢形成各種感受器；運動神經末梢分布于骨骼肌肉，形成運動終極。

大腦皮質是調節軀體運動或者說控制軀體運動的最高級中樞，主要含有錐體形細胞、梭形細胞和星形細胞（顆粒細胞）及神經纖維。對皮層神經元進行分離、體外培養，便于神經科學研究中細胞生物學實驗的需求。

發明內容

針對上述技術問題，本發明提供了一種SD大鼠皮層神經元培養方法，具體技術方案如下：

一種SD大鼠皮層神經元培養方法，包括以下步驟：

神經細胞專用培養基制備：

超凈工作臺內取96ml Neurobasal A基礎培養基于無菌、干凈的瓶內，加入2ml B27、1ml青鏈霉素雙抗、1ml谷氨酰胺，0.22um過濾器過濾后轉移至新的瓶內，蓋緊瓶蓋；瓶子上標明培養基名稱、配制日期、配制人后纏緊封口膜，4℃冰箱保存備用；

SD大鼠皮層神經元細胞提取培養：

步驟A：取剛出生1天的新生SD大鼠4只，體積百分比為75%的乙醇浸泡淹死；

步驟B：取四個10cm培養皿，每個皿內加入約10ml解剖液；

步驟C：將步驟A中得到的新生SD大鼠放入第一個培養皿中，讓解剖液充分浸泡新生SD大鼠，將新生SD大鼠頭部取下；

步驟D：將步驟C中取下的頭部轉移到第二個盛有解剖液的培養皿內，除去頭部皮膚；

步驟E：將步驟D中除去頭部皮膚的大鼠頭部使用顯微鑷撕開顱骨，撕開顱骨后，用眼科鑷固定住頭部，用顯微鑷撕掉顱骨，暴露出整個大腦；

步驟F：將步驟E中取得的大腦轉移至第三個盛有解剖液的培養皿內，體式顯微鏡下找到腦膜，用顯微彎鑷固定住腦部，用顯微直鑷撕除腦膜；用顯微剪輕輕剪下大腦皮層組織，厚度0.5mm，放入第四個盛有解剖液的培養皿內，轉移至超凈工作臺內；

步驟G：將取下來的大腦皮層組織在解剖液內剪成約0.5mm³大小，用巴氏吸管將組織塊連同解剖液轉移至15ml離心管內；1000rmp/min離心3min，棄上清；2ml 0.25%胰酶消化9分30秒，加入4ml DMEM/F12終止消化；巴氏吸管吹打20次，靜置3min使未吹散的組織塊沉降，吸取上層皮層神經元細胞懸液至新的15ml離心管內；重復此操作兩次；1000rmp離心5min收集細胞，棄上清，用5ml DMEM/F12完全培養基重懸細胞；

步驟H：在六孔板每個孔接種5X10⁵個細胞；接種細胞后培養箱內培養，4h時細胞開始貼壁；培養24h時細胞長出形態，但形態并未完全伸展；培養3d時細胞完全長出形態，呈網狀生長；培養5d時培養完成。