[發明專利]CRISPR-CAS9修飾的CD34+人血色素干細胞和祖細胞及其用途

在審

• 申請號: 201880087056.1
• 申請日: 2018-12-05
• 公開（公告）號: CN111629747A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: E.莫拉瓦;T.查克拉博蒂;A.S.倫德伯格;T.霍;L.桑德勒;B.尤斯塔斯;J.羅瑟特;R.考夫曼
• 申請（專利權）人: 沃泰克斯藥物股份有限公司
• 主分類號: A61K38/46
• 分類號: A61K38/46;C12N9/22;C12N15/10;C12N15/113
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務所 11105
• 代理人: 張文輝

1.一種組合物，其包含CD34+人造血干細胞和祖細胞(hHSPC)，所述CD34+hHSPC在人B-細胞淋巴瘤11A(BCL11A)基因的紅細胞譜系特異性增強子內的+58DNA酶I超敏位點(DHS)內包含遺傳修飾。

2.如權利要求1所述的組合物，其還包含基本上不含血清、5％二甲亞砜(DMSO)和/或葡聚糖-40的冷凍保存培養基。

3.如權利要求1或2所述的組合物，其中所述遺傳修飾包含插入缺失。

4.如權利要求1-3中任一項所述的組合物，其中所述遺傳修飾通過向CD34+hHSPC遞送Cas9內切核酸酶和靶向人BCL11A基因的+58DHS的導向RNA(gRNA)而產生。

5.如權利要求4所述的組合物，其中所述gRNA包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

6.如權利要求5所述的組合物，其中所述gRNA在其5’端和3’端中的每一個處或其附近包含三個2’-O-甲基-硫代磷酸酯殘基。

7.如權利要求4-6中任一項所述的組合物，其中所述Cas9內切核酸酶是化膿性鏈球菌Cas9內切核酸酶或其變體。

8.如權利要求1-7中任一項所述的組合物，其中所述修飾的CD34+hHSPC表現出0.1至0.5的γ/(γ+α)-珠蛋白mRNA比增加，和/或其中所述修飾的CD34+hHSPC表現出0.2至0.6的γ/(γ+β)-珠蛋白mRNA比增加。

9.如權利要求1-8中任一項所述的組合物，其中所述修飾的CD34+hHSPC表現出15％至50％的HbF/(HbF+HbA)蛋白水平的HbF平均百分比。

10.如權利要求1-9中任一項所述的組合物，其中所述修飾的CD34+hHSPC表現出70％至90％的平均等位基因編輯頻率。

11.如權利要求1-10中任一項所述的組合物，其中在向受試者施用所述修飾的CD34+hHSPC之后，至少75％的所述修飾的CD34+hHSPC維持多譜系潛能至少十六周。

12.如權利要求1-11中任一項所述的組合物，其中所述修飾的CD34+hHSPC表現出至少40％的中靶插入缺失率。

13.如權利要求12所述的組合物，其中所述修飾的CD34+hHSPC表現出至少80％的中靶插入缺失率。

14.如權利要求1-13中任一項所述的組合物，其中所述修飾的CD34+hHSPC表現出小于5％的脫靶插入缺失率。

15.如權利要求1-14中任一項所述的組合物，其中所述修飾的CD34+hHSPC表現出小于1％的脫靶插入缺失率。

16.如權利要求1-15中任一項所述的組合物，其包含單劑量的所述修飾的CD34+hHSPC。

17.如權利要求16所述的組合物，其中所述單劑量包含至少至少2×10⁶個修飾的CD34+hHSPC/kg。

18.如權利要求1-17中任一項所述的組合物，其中所述遺傳修飾通過向所述CD34+hHSPC遞送包含N-末端SV40核定位信號(NLS)的化膿性鏈球菌Cas9內切核酸酶或其變體而產生。

19.如權利要求18所述的組合物，其中所述化膿性鏈球菌Cas9內切核酸酶或其變體還包含C-末端NLS，任選地C-末端SV40 NLS。