[發(fā)明專利]酶篩選方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880068428.6
• 申請日: 2018-08-22
• 公開（公告）號: CN111356772B
• 公開（公告）日: 2023-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: A.阿耶;G.M.丘奇;M.帕拉;F.佩平;S.S.R.A.蓬塔姆巴克;P.B.斯特蘭杰斯
• 申請（專利權(quán)）人: 豪夫邁·羅氏有限公司;哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6837
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 甘霖;黃希貴

本發(fā)明涉及使用基于納米孔的測序以多重方式推導(dǎo)至少兩種不同的酶變體的多種動力學(xué)參數(shù)(240)的組合物和方法。在一些實施方案中，所述系統(tǒng)和方法可用于篩選不同的納米孔變體，或納米孔變體和酶變體兩者的不同組合。

關(guān)于聯(lián)邦資助的研究的聲明

本發(fā)明用美國國家科學(xué)基金會授予的1445570下的政府支持進行。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。

相關(guān)申請的交叉引用

本發(fā)明要求在2017年8月23日提交的美國臨時專利申請?zhí)?2/549,246的申請日的權(quán)益，所述美國臨時專利申請的公開內(nèi)容在此以其整體通過引用并入本文。

發(fā)明背景

DNA測序的重要性自四十年前其開始時已急劇增加。其被認為是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的大多數(shù)領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)，且被認為是個性化和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的新范式的基礎(chǔ)。關(guān)于個體的基因組和表觀基因組的信息可以幫助揭示他們的疾病傾向、臨床預(yù)后以及對治療法的應(yīng)答，但基因組測序在醫(yī)學(xué)中的常規(guī)應(yīng)用將需要以及時且經(jīng)濟有效的方式提供全面的數(shù)據(jù)。

基于納米孔的核酸測序是已被廣泛研究的方法。在過去的二十年中，已非常關(guān)注利用納米孔用于聚合物表征和用于以低成本、快速、單分子的方式區(qū)分核苷酸。例如，Kasianowicz等人表征單鏈多核苷酸，因為它們通過嵌入脂質(zhì)雙層中的α溶血素納米孔電移位(參見，例如，Kasianowicz, J. (1996), Characterization of IndividualPolynucleotide Molecules using a Membrane Channel. Proc. Natl. Acad. Sci.,93, 13770-3)。據(jù)表明，在多核苷酸移位期間，隨著離子電流的降低，可以測量納米孔孔徑的部分阻斷。類似地，Gundlach等人證明了一種測序DNA的方法，其結(jié)合被稱為雙鏈體中斷測序的過程使用源自恥垢分枝桿菌的低噪聲納米孔(“MspA”)(參見，例如，Derrington, I.等人 (2010), Nanopore DNA Sequencing with MspA. Proc. Natl. Acad. Sci., 107(37), 16060-16065)。此處，使用雙鏈雙鏈體將核酸的單鏈部分暫時保持在MspA壓縮物中。Akeson等人 (參見，例如，PCT公開號WO/20150344945)公開了用于表征納米孔中的多核苷酸的方法，其利用鄰近定位的分子馬達來控制多核苷酸通過或鄰近納米孔孔的移位速率。

一般地，已經(jīng)追求三種納米孔測序方法：鏈測序，其中當(dāng)DNA的堿基依次穿過納米孔時鑒別它們；基于外切核酸酶的納米孔測序，其中核苷酸從DNA分子被一個接一個酶促切割并且當(dāng)它們被納米孔捕獲并穿過納米孔時進行監(jiān)測；和納米孔邊合成邊測序(SBS)方法，其中可鑒別的聚合物標(biāo)簽附接至核苷酸并在酶催化的DNA合成期間在納米孔中記錄。所有這些方法共同的是需要精確控制反應(yīng)速率，使得按順序確定每個堿基。鏈測序需要用于減慢DNA穿過納米孔和解碼通道內(nèi)的多個堿基的方法；為此目的，已經(jīng)開發(fā)了利用分子馬達的棘輪方法。基于外切核酸酶的測序需要釋放足夠接近孔的每個核苷酸，以確保其捕獲和其以足夠慢的速率通過孔轉(zhuǎn)運，以獲取有效的離子電流信號。另外，這兩種方法均依賴于四種天然堿基(兩種相對類似的嘌呤和兩種類似的嘧啶)之間的區(qū)別。納米孔SBS方法利用附接至核苷酸的合成聚合物標(biāo)簽，其經(jīng)專門設(shè)計以產(chǎn)生獨特且容易區(qū)分的離子電流阻斷特征用于序列測定。

DNA聚合酶是通過從親本模板合成新的互補DNA鏈而復(fù)制遺傳信息、由此保持遺傳信息的酶。迄今為止，已經(jīng)通過定向進化生成聚合酶突變體，并且用于DNA聚合酶突變體的大規(guī)模篩選的方法已經(jīng)是誘變、噬菌體展示和隔室化的自我復(fù)制方法。這已經(jīng)導(dǎo)致鑒別和開發(fā)不同的聚合酶用于許多生物技術(shù)應(yīng)用。

發(fā)明概述