[發(fā)明專利]酶篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880068428.6
• 申請(qǐng)日: 2018-08-22
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111356772B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A.阿耶;G.M.丘奇;M.帕拉;F.佩平;S.S.R.A.蓬塔姆巴克;P.B.斯特蘭杰斯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 豪夫邁·羅氏有限公司;哈佛大學(xué)校長(zhǎng)及研究員協(xié)會(huì)
• 主分類號(hào): C12Q1/6869
• 分類號(hào): C12Q1/6869;C12Q1/6837
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 甘霖;黃希貴

1.使用基于納米孔的測(cè)序來(lái)篩選多種不同酶變體的方法，其包括：

a. 獲得包括多種不同納米孔測(cè)序復(fù)合物的生物芯片，其中所述多種不同納米孔測(cè)序復(fù)合物的每種不同納米孔測(cè)序復(fù)合物包括具有獨(dú)特分子條形碼的多核苷酸，且其中所述不同納米孔測(cè)序復(fù)合物中的至少兩種具有不同的酶變體；

b. 對(duì)于裝載至所述芯片上的每種不同納米孔測(cè)序復(fù)合物生成測(cè)序數(shù)據(jù)集；

c. 基于所述不同納米孔測(cè)序復(fù)合物的多核苷酸中包括的獨(dú)特分子條形碼的鑒別，將生成的測(cè)序數(shù)據(jù)集各自分類為與多種不同酶變體中的一種不同酶變體相關(guān)；和

d. 對(duì)于所述多種不同酶變體中的酶變體中的每一種推導(dǎo)多種參數(shù)，其中基于與所述不同酶變體中的相應(yīng)一種相關(guān)的分類的序列數(shù)據(jù)集，推導(dǎo)所述不同酶變體中的每一種的多種參數(shù)。

2.權(quán)利要求1的方法，其中在所述不同納米孔測(cè)序復(fù)合物中包括的獨(dú)特分子條形碼的鑒別包括：(i)過(guò)濾質(zhì)量讀取值以滿足最小閾值堿基長(zhǎng)度；(ii)使用基于自動(dòng)化比對(duì)的算法推導(dǎo)概率評(píng)分；和(iii)評(píng)估計(jì)算的概率評(píng)分是否至少滿足預(yù)定的閾值概率評(píng)分值。

3.權(quán)利要求2的方法，其中所述預(yù)定的閾值概率評(píng)分值為0.80。

4.權(quán)利要求3的方法，其中基于自動(dòng)化比對(duì)的分類算法通過(guò)如下推導(dǎo)概率評(píng)分：(i)鑒別原始讀取值中的所有條形碼迭代邊界；(ii)將所述迭代邊界分為單獨(dú)的條形碼讀取值；(iii)使用自動(dòng)化多序列比對(duì)算法比對(duì)單獨(dú)的條形碼讀取值，以從所述比對(duì)生成共有條形碼；(iv)將生成的共有條形碼與所述篩選中利用的所有可能的條形碼進(jìn)行局部比對(duì)；和(v)基于序列同一性來(lái)鑒別最可能的條形碼候選物。

5.權(quán)利要求1的方法，其中被分類為與一種不同酶變體相關(guān)的單一序列數(shù)據(jù)集被用于推導(dǎo)該一種不同酶變體的多種參數(shù)。

6.權(quán)利要求1的方法，其中被分類為與一種不同酶變體相關(guān)的至少兩個(gè)序列數(shù)據(jù)集被用于推導(dǎo)該一種不同酶變體的多種參數(shù)。

7.權(quán)利要求1的方法，其中所述不同酶變體中的每一種的多種參數(shù)選自停留時(shí)間、標(biāo)記核苷酸并入的完整催化循環(huán)的速率、核苷酸并入后相關(guān)的標(biāo)簽釋放、標(biāo)簽捕獲率和標(biāo)簽捕獲停留時(shí)間。

8.權(quán)利要求7的方法，其中對(duì)于每種不同核苷酸類型推導(dǎo)多種參數(shù)。

9.權(quán)利要求8的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)推導(dǎo)的多種不同酶變體中的不同酶變體中的每一種的多種參數(shù)進(jìn)行主成分分析。

10.權(quán)利要求8的方法，其進(jìn)一步包括評(píng)估所述多種不同酶變體的第一不同酶變體與所述多種不同酶變體的第二不同酶變體相比至少一個(gè)核苷酸的持續(xù)合成速率是否改變。

11.權(quán)利要求10的方法，其中所述評(píng)估包括將所述第一不同酶變體的多種參數(shù)中的至少一種參數(shù)與所述第二不同酶變體的相同的至少一種參數(shù)進(jìn)行比較。

12.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。

13.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶是聚合酶。

14.權(quán)利要求13的方法，其中所述不同納米孔測(cè)序復(fù)合物中的至少三種包含三種不同的聚合酶變體。

15.權(quán)利要求14的方法，其中所述至少三種不同的聚合酶變體之一是對(duì)照，且其中其他不同的聚合酶變體各自包括至少一個(gè)與對(duì)照相比不同的突變。

16.權(quán)利要求1的方法，其中所述獨(dú)特分子條形碼包含具有10至50個(gè)堿基的核酸序列。

17.權(quán)利要求16的方法，其中所述獨(dú)特分子條形碼各自與彼此具有小于85%序列同一性。