[發(fā)明專利]生物樣品的成像方法和相應(yīng)的探針

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201880055465.3
• 申請日: 2018-07-27
• 公開（公告）號: CN111226115A
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅伯托·馬洛塔;蒂齊亞諾·卡特拉尼;毛羅·莫格利亞內(nèi)蒂;埃莉莎·德盧卡;皮爾·保羅·皮穆帕
• 申請（專利權(quán)）人: 意大利學(xué)院科技基金會
• 主分類號: G01N33/533
• 分類號: G01N33/533;G01N33/68;B01J23/89;B01J35/02;G01N33/543;G01N33/58
• 代理公司: 深圳中一聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44414
• 代理人: 王麗

使用顯微鏡的生物樣品的成像方法，例如熒光光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡或關(guān)聯(lián)顯微鏡，其提供了使用成像探針來獲得圖像，在圖像中可能可以識別成像探針和/或與它們相關(guān)的分子。本發(fā)明還涉及可以功能化的成像探針，所述探針可以用于CLEM實(shí)驗(yàn)和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明的制劑涉及使用可用于顯微鏡，特別是熒光光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡或關(guān)聯(lián)顯微鏡(CLEM光電關(guān)聯(lián)顯微鏡)，中的成像探針對生物樣品進(jìn)行成像的方法。

此處和下文中，成像我們指獲取生物樣品或其一部分(例如細(xì)胞)的圖像，其中可以識別成像探針和/或與之相關(guān)的分子。

本發(fā)明還涉及用于通過顯微鏡對生物樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的成像探針，例如免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)或鑒定目標(biāo)特定分子的實(shí)驗(yàn)。

背景技術(shù)

CLEM是生物領(lǐng)域的主要顯微鏡技術(shù)之一，因?yàn)樗ǔ？梢钥梢暬⒆R別和跟蹤生物樣品中特定分子在由幾十微米到幾納米定義的空間尺度上的運(yùn)動(dòng)。

該技術(shù)結(jié)合了熒光光學(xué)顯微鏡(FOM)和透射電子顯微鏡(TEM)的優(yōu)勢，從而能夠高精度地在生物樣品中定位目標(biāo)特定分子。

其他電子顯微鏡技術(shù)提供了進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)的機(jī)會，在該特定領(lǐng)域中也稱為免疫金，在納米尺度上定位生物樣品中的特定抗原。

在這些實(shí)驗(yàn)中，使用的探針通常由膠體金納米顆粒與能識別并結(jié)合特定抗原的抗體或蛋白質(zhì)共軛而成。

在這種情況下，變得有必要能夠使用可用于CLEM并進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)的探針，以使高精度檢測特定分子而不會在生物樣品中產(chǎn)生假象和/或改變。

由量子點(diǎn)或量子棒組成的探針是已知的，或者由與電子致密納米顆粒(例如，具有約1nm直徑的金納米顆粒，在該特定領(lǐng)域中也稱為“納米金”)共軛的熒光團(tuán)組成的組合探針。

盡管此類探針能夠穿透生物樣品中可能存在的單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部，但使用TEM很難檢測，需要通過稱為銀或金增強(qiáng)的吸積通道。

這種吸積通道需要在一種或多種還原劑存在下，使用銀鹽或金鹽的溶液，這需要添加非特異性貢獻(xiàn)，這使得獲得的圖像解釋有問題。

其他CLEM探針利用與之關(guān)聯(lián)的分子熒光，以將聯(lián)苯胺的衍生物，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)光轉(zhuǎn)換為DAB聚合物，形成TEM清晰可見的親鋨性沉淀。

但是，如果要通過電子顯微鏡進(jìn)行雙重免疫定位，則這些探針需要使用由抗生物素蛋白和生物素化的過氧化物酶組成的復(fù)合物，這些復(fù)合物通過與第一抗體結(jié)合而氧化DAB，使其具有親鋨性，因此對于TEM可見。

從能量角度和成本角度來看，這都是昂貴的，因?yàn)樗枰^長的操作時(shí)間。

作為光轉(zhuǎn)化的替代，也可以通過與過氧化物酶共軛的探針，特別是辣根過氧化物酶(HRP)，來生產(chǎn)DAB親鋨性聚合物。

與“納米金”不同，HRP酶不僅保持其大小不變，而且對pH、溫度和壓力條件敏感。

這意味著HRP酶不能滲透到單個(gè)細(xì)胞內(nèi)部，相對于其所在的環(huán)境條件，它經(jīng)常會發(fā)生變性。

因此，與HRP酶共軛的探針必須恒定地保持在受控環(huán)境中。

一些已知的解決方案提供了使用包括摻雜有能夠與特定分子偶聯(lián)的發(fā)光離子的晶格的無機(jī)納米顆粒，以允許在生物樣品中對其進(jìn)行檢測。

例如，文獻(xiàn)EP-A-1.801.593提供了使用復(fù)雜的無機(jī)納米粒子，例如無機(jī)鹽、氧化物或半導(dǎo)體的晶格，承載了激活發(fā)光的稀土陽離子或過渡金屬。

由于與生物樣品成分的典型尺寸相比尺寸較大，這些已知的晶格可能潛在地干擾與其相關(guān)的特定分子以及生物樣品本身。

此外，這些已知的晶格通常具有高毒性，因此可以顯著改變生物樣品的行為。