[發明專利]聚山梨醇酯的定量分析

在審

• 申請號: 201880049273.1
• 申請日: 2018-06-26
• 公開（公告）號: CN111033261A
• 公開（公告）日: 2020-04-17
• 發明（設計）人: A·馬托斯-桑切斯;A·哈韋
• 申請（專利權）人: 科里奧利醫藥研究有限責任公司
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;B01L3/00
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 黃琳娟

本發明涉及一種定量樣品中聚山梨醇酯的方法，包括以下步驟：a)提供包含至少一種聚山梨醇酯的樣品；b)將樣品與羰花青染料混合；c)測定混合物的熒光；及d)將熒光與聚山梨醇酯的含量相關聯。

背景技術

聚山梨醇酯是一類非離子型表面活性劑，在藥品和食品工業中廣泛用作賦形劑。聚山梨醇酯20(PS20)和聚山梨醇酯80(PS80)-亦稱為吐溫20(20)和吐溫80(80)-是最常用的表面活性劑，用于防止治療蛋白吸附到界面和相關的不穩定情況。PS20和PS80在生物藥品中對蛋白質穩定性的貢獻得到了廣泛認可，它們都是監管機構批準的腸胃外給藥賦形劑。大多數包含肽、蛋白質、抗體和疫苗的生物制藥產品都采用聚山梨醇酯配制。例如，大約80％的商業單克隆抗體(MAb)都含有PS20或PS80。它們較高的親水親油平衡值(HLB)及較低的臨界膠束濃度(CMC)使它們即使在低濃度下也具有非常高的表面活性。生物藥品中聚山梨醇酯的典型濃度是0.001-0.1％(w/v)，對應于0.01-1mg/ml。

雖然人們對其穩定作用的分子詳細情況尚未完全了解，但眾所周知的是聚山梨醇酯通過兩種不同的機制穩定蛋白質，即(i)競爭吸附到疏水界面上和/或(ii)直接與蛋白質結合。在第一種機制中，與蛋白質相比，聚山梨醇酯每單位面積的吸附能量更大，從而與蛋白質有效競爭，防止其吸附到疏水界面上。此外，聚山梨醇酯可以與蛋白質直接相互作用，通過與暴露的疏水區結合及保護暴露的疏水區而提高其在溶液中的穩定性。這樣通過減少蛋白質-蛋白質之間的相互作用，防止蛋白質聚集。對具體的蛋白質的穩定來說，這兩種機制中哪種機制占主導作用取決于蛋白質及聚山梨醇酯。

聚山梨醇酯具有兩親性結構。它們的親水性級分包含脫水山梨糖醇頭部基團，每個羥基與聚乙二醇鏈(PEG/聚氧化乙烯鏈/POE)結合。疏水性部分的特點是其羥基被酯化的脂肪酸(FA)。從理論上來說，不同的聚山梨醇酯可以通過那些脂肪酸區分。實際上，商業聚山梨醇酯包含結構上相關的分子，僅大約20％(w/w)的聚山梨醇酯材料與理論分子結構相符。

除合成期間形成的副產物之外，降解反應(氧化和水解)可能也是聚山梨醇酯溶液不均勻的原因。聚山梨醇酯降解產物的形成會導致制劑內表面活性劑濃度損失。

除此之外，它們還可能喪失表面活性劑性質。這可能影響蛋白質的穩定性，并且會導致形成蛋白質聚集體和顆粒。因此，必須防止降解反應。聚山梨醇酯的降解綜述及它們的降解分析見Martos,A.et.al.；Journal of Pharmaceutical Sciences；2017；doi:10.1016/j.xphs.2017.03.001。

由于對治療蛋白制劑中聚山梨醇酯的濃度及聚山梨醇酯的降解進行監測是非常重要的，因此，人們已經開發了幾種分析樣品中聚山梨醇酯含量及其降解產物含量的方法。通常，在脫除蛋白質(例如，通過有機溶劑使蛋白質沉淀或通過固相萃取)的樣品制備后，使樣品通過反相液相色譜(RP-HPLC)，從而分離樣品的各組分(聚山梨醇酯)，并采用質譜、ELSD或CAD檢測對它們進一步進行分析。此外，聚山梨醇酯80可以在水解釋放出油酸后，采用紫外/可見光(UV/Vis)檢測。這些方法中的大多數方法比較復雜、耗時長，并且對蛋白質干擾比較敏感。接下來，是采用這種熒光染料法進行定量。最常見的分析方法是基于N-苯基-1-萘胺(NPN)的熒光膠束分析(FMA)，這種方法依據的是熒光染料與特別是超過CMC的膠束中存在的疏水環境之間的相互作用。這種分析方法的缺點是缺乏PS的特異性(即NPN可能與蛋白質、硅油相互作用，而且可能受到溶液粘度的影響)，并且PS的定量僅在濃度超過CMC時才可行。

因此，本發明的目的是提供能夠快速理想地自動或半自動檢測和定量聚山梨醇酯的新方法。

發明內容

本發明人驚訝地發現，樣品中聚山梨醇酯的含量可以采用羰花青染料，特別是選自1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽(DiI)或其衍生物DID(1,1'-雙十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二羰花青4-氯苯磺酸鹽)和DiO(3,3'-雙十八烷基氧代羰花青高氯酸鹽)的羰花青染料準確地定量。